應(yīng)用改良RACE法釣取櫛江珧抗菌肽基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近幾年來的研究表明，抗菌肽是生物在漫長(zhǎng)進(jìn)化歷程中保存下來的天然免疫機(jī)制之一，并且已經(jīng)在海洋軟體動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了一些新的抗菌肽家族成員。該家族是由特定基因編碼的一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。在雙殼貝類中，貽貝的抗菌肽研究較為透徹，而其他雙殼貝類的抗菌肽研究報(bào)道不多，因而其他貝類抗菌肽是一個(gè)有很大研究開發(fā)價(jià)值的領(lǐng)域。隨著許多抗菌肽cDNA成功地克隆，研究人員正逐漸放棄從低等動(dòng)物血淋巴直接分離純化(如酸提、層析等)抗菌肽的繁瑣步驟，轉(zhuǎn)而利用現(xiàn)

2、代分子生物技術(shù)結(jié)合基因工程方法獲得大量的新的抗菌肽。 目的： 1.初步建立一種全新的基于“cDNA末端快速擴(kuò)增PCR”(RACE)的雙殼貝類櫛江珧抗菌肽基因cDNA快速篩選鑒定方案； 2.運(yùn)用新的初步篩選方案釣取與雙殼貝類抗菌肽基因具有高同源性的基因并克隆其基因。 方法： 1.總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄從櫛江珧閉殼肌抽取血淋巴，TRIzol法提取血細(xì)胞總RNA，采用AMVReverseTran

3、scriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 2.抗菌肽基因篩選方案一1)根據(jù)已知抗菌肽Mytilins的cDNA5′端保守序列設(shè)計(jì)抗菌肽基因特異性引物，另一個(gè)引物與mRNA差異顯示法(DDRT-PCR法)簡(jiǎn)化的錨定引物相同；2)利用錨定引物和基因特異性引物進(jìn)行3′cDNA末端快速擴(kuò)增PCR(3′RACE)，獲得帶有雙殼貝類抗菌肽cDNA3′端保守序列的擴(kuò)增產(chǎn)物；3)擴(kuò)增產(chǎn)物通過AT克隆法連接至pGEM-TEasy載體中，

4、挑選陽(yáng)性重組子并進(jìn)行DNA序列分析； 4)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST，與GenBank和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗菌肽基因進(jìn)行同源性比較。 3.抗菌肽基因篩選方案二 1)根據(jù)Mytilins基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性簡(jiǎn)并引物，用5′RACE試劑盒進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增PCR(5′RACE)； 2)擴(kuò)增獲得帶有雙殼貝類抗菌肽保守序列cDNA的5′端基因片段，經(jīng)AT克隆至pGEM-TEasy載體中；

5、3)挑選陽(yáng)性重組子，進(jìn)行DNA序列分析； 4)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST，與GenBank和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的抗菌肽基因進(jìn)行同源性比較。 結(jié)果： 1.通過3′cDNA末端快速擴(kuò)增法從櫛江珧血淋巴總RNA擴(kuò)增出多個(gè)帶有雙殼貝類抗菌肽保守序列的3′端基因片段，其長(zhǎng)度在800bp以下； 2.AT克隆至pGEM-TEasy載體中構(gòu)建重組載體，篩選出陽(yáng)性重組子及進(jìn)行DNA全序列分析得到2個(gè)未知基因的3′端堿基序

6、列信息； 3.根據(jù)設(shè)計(jì)的Mytilins基因特異性簡(jiǎn)并引物，用5′cDNA末端快速擴(kuò)增法從櫛江珧血淋巴總RNA擴(kuò)增出多個(gè)帶有雙殼貝類抗菌肽保守序列未知基因的5′端基因片段，其長(zhǎng)度在800bp以下； 4.進(jìn)行AT克隆，篩選出陽(yáng)性重組子克隆并進(jìn)行DNA序列分析得到3個(gè)未知基因的5′端堿基序列信息； 5.根據(jù)上述兩種方法篩選得到的未知基因堿基序列信息與數(shù)據(jù)庫(kù)中雙殼貝類抗菌肽cDNA序列進(jìn)行同源性比較顯示與抗菌肽M

7、ytilins基因同源性不高； 6.由于時(shí)間的限制未能進(jìn)一步進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA克隆，獲得cDNA的全部堿基序列信息。因此，尚無法確定上述獲得的帶有雙殼貝類抗菌肽保守序列的5個(gè)未知基因片段是否為新的抗菌多肽基因。 結(jié)論：利用設(shè)計(jì)的錨定引物、基因特異性引物和簡(jiǎn)并引物，運(yùn)用3′RACE和5′RACE等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，在櫛江珧釣取出帶有雙殼貝類抗菌肽保守序列的未知基因。本實(shí)驗(yàn)對(duì)初步建立一種全新的雙殼貝類抗菌肽基因cDNA快速