改良cDNA末端快速擴(kuò)增PCR篩選扇貝抗菌肽基因方法的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究的目的是：1.尋找一種有效的基于基因序列同源性的PCR篩選雙殼類抗菌肽(AntimicrobialPeptide，AMP)基因的方法。2.應(yīng)用改良3'cDNA末端快速擴(kuò)增PCR法(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)和5'RACE法，進(jìn)行篩選扇貝抗菌肽基因的初步研究。 [方法] 1.改良3'RACE法從扇貝血淋巴篩選抗菌肽基因 (1)從扇貝血淋巴中提取總RNA。利用M1

2、3和T7啟動(dòng)子分別修飾的基因特異性引物(GeneSpecialPrimer，GSP)和錨定引物，對(duì)扇貝血淋巴總RNA進(jìn)行RT-PCR初步擴(kuò)增，其后再利用M13和T7啟動(dòng)子序列進(jìn)行嵌套PCR擴(kuò)增。 (2)3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)柱純化后克隆至pGEM-TEasy載體，篩選陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析。 (3)獲得的cDNA3'端序列通過BLAST程序與GenBank中的抗菌肽基因進(jìn)行同源性比較分析。 (4)根據(jù)測

3、序結(jié)果，對(duì)感興趣的基因片段設(shè)計(jì)另一個(gè)基因特異性引物，進(jìn)行5'RACE，擴(kuò)增該基因cDNA的5'端序列。 (5)5'RACE擴(kuò)增得到的5'端序列克隆至pCR4-TOPO載體，篩選陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析。 (6)所得cDNA準(zhǔn)全長序列應(yīng)用BLAST程序與GenBank中的抗菌肽基因進(jìn)行同源性比較分析。 2.改良5'RACE法從扇貝血淋巴篩選抗菌肽基因 (1)從扇貝血淋巴中提取總RNA。

4、(2)根據(jù)貽貝抗菌肽MGDs的保守序列設(shè)計(jì)基因特異性簡并引物，進(jìn)行改良5'RACE釣取可能抗菌肽基因cDNA的5'端序列，克隆至T載體，篩選陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析。 (3)所得cDNA5'端序列應(yīng)用BLAST程序與GenBank中的抗菌肽基因進(jìn)行同源性比較分析。 [結(jié)果] 1.采用改良3'RACE法從扇貝血淋巴RNA中釣取得到多個(gè)未知基因的cDNA3'端序列，其長度在200bp～800bp之間。

5、 2.改良3'RACE產(chǎn)物成功克隆至pGEM-TEasy載體，挑選部分陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析，獲得了4個(gè)未知基因的3'端序列。搜索GenBank核酸數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)與之高度同源的基因。 3.5號(hào)陽性克隆插入基因進(jìn)行5'RACE擴(kuò)增和克隆，挑選陽性克隆測序后獲得長度為448bp的插入基因5'端序列。5'端序列和3'端序列經(jīng)過拼接得到的5號(hào)克隆插入基因cDNA準(zhǔn)全長序列，其長度為544bp。 4.搜索GenBank核

6、酸數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)與5號(hào)陽性克隆插入基因準(zhǔn)全長cDNA高度同源的基因。 5.采用改良5'RACE從扇貝血淋巴RNA中釣取得到多個(gè)未知基因的cDNA5'端序列。 6.在改良5'RACE產(chǎn)物中挑選長度在600bp以下的三個(gè)基因片段進(jìn)行AT克隆，篩選出陽性克隆并進(jìn)行DNA序列分析，得到3個(gè)插入片段序列，其長度分別為257bp、275bp和511bp。通過BLAST程序搜索GenBank核酸數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)與之高度同源的基因。