氫氣通過抑制ASK1-JNK通路減輕大鼠慢性氧中毒的研究.pdf

1、氧氣是臨床治療各種疾病常用的輔助手段，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是高壓氧治療，高壓氧治療通過提高氧氣在血漿中溶解量，增加血氧分壓，改善組織氧供。但是長時間吸入高濃度氧（氧分壓超過50％）會導(dǎo)致慢性氧中毒(COT)，研究表明，其發(fā)生機制主要是：高濃度氧進(jìn)入機體后，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），過量的活性氧會導(dǎo)致肺部發(fā)生廣泛的炎性反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷，從而使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡，最終引起肺組織結(jié)構(gòu)病變及肺功能障礙。有研

2、究表明，絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號途徑在慢性氧中毒所引起的肺損傷中具有重要功能，細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKK)家族成員之一，是連接ROS和MAPKs通路的關(guān)鍵分子，在慢性氧中毒中被激活，通過MKK3/6和MKK7激活下游P38和JNK蛋白激酶從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致多種應(yīng)激損傷和促炎因子的釋放，參與病理生理過程，有報道稱，除ROS外，胞內(nèi)鈣離子濃度升高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腫瘤壞死因子均可誘

3、導(dǎo)ASK1的表達(dá)。最近的研究表明，ASK1抑制劑對氧中毒肺損傷具有保護作用，ASK1敲除后，細(xì)胞IL-1β、IL-6以及TNF-α釋放量降低，炎癥反應(yīng)減弱。
　　在臨床上治療中，若患者發(fā)生慢性氧中毒則會出現(xiàn)非常令人尷尬的局面：如果不提高呼吸氣體的氧濃度會引發(fā)缺氧，然而氧氣本身會對肺產(chǎn)生損傷效應(yīng)，若提高呼吸氣體的氧濃度則會導(dǎo)致肺功能進(jìn)一步惡化，因此一旦患者遇到這種緊張矛盾的局面，臨床醫(yī)生往往無計可施。研究發(fā)現(xiàn)，在救治急性呼吸衰竭病人

4、以及早產(chǎn)兒時，常需長期吸氧，結(jié)果導(dǎo)致氧中毒肺功能損傷，部分嬰兒會發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良、肺間質(zhì)纖維化、肺部炎癥等病理現(xiàn)象，重者甚至?xí)l(fā)嚴(yán)重的肺功能障礙，因此臨床用氧受到了一定程度的限制。此外在潛水作業(yè)領(lǐng)域，為了避免發(fā)生氧中毒的現(xiàn)象，必須嚴(yán)格限定吸入氣體中的氧分壓以及持續(xù)吸氧時間，同時也嚴(yán)重影響了作業(yè)效率。因此，深入探討研究慢性氧中毒的防治措施及其保護機制對臨床和軍事具有重要意義。
　　關(guān)于慢性氧中毒主要以預(yù)防為主，患者若需常期高壓

5、氧治療，則需要使用自由基清除劑輔助治療，且在治療過程中需要采用間斷式的吸氧方式，防止氧中毒的發(fā)生，但是到目前為止在氧中毒的治療上仍沒有有效手段。
　　近年來對氫氣的作用機制研究進(jìn)展迅速，氫氣有望成為一種新型的氣體信號分子發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。2007年有學(xué)者首次報道，吸入2%的氫氣可有效地減輕大腦缺血再灌注損傷。在肺部疾病治療方面，有報道證實氫氣可顯著減輕燒傷后肺損傷，同時對機械通氣所造成的肺損傷以及肺的缺血再灌注損傷具有顯著的治

6、療效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：氫氣飽和生理鹽水可以通過降低高分壓氧暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而減輕慢性氧中毒肺功能損傷，本研究基于前期工作進(jìn)一步從凋亡及其信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)方面探討氫氣發(fā)揮氧中毒保護效應(yīng)的機制。
　　本研究首先明確氫氣對慢性氧中毒的保護作用。首先，建立大鼠慢性氧中毒模型（吸入98%純氧，氧艙持續(xù)暴露60小時，每12小時進(jìn)行腹腔注射生理鹽水、氫氣飽和生理鹽水（10ml/kg）進(jìn)行治療，共4次，時間點分別為動物進(jìn)艙后12、24

7、、36、48小時，暴露共60小時后，動物出艙），以吸入常氧空氣組為對照，效應(yīng)學(xué)指標(biāo)采用肺臟濕干比和胸膜腔滲出液含量測定，血氣分析檢測動脈血氧飽和度，肺組織切片HE染色觀察肺臟病理改變，TUNEL染色觀察肺組織細(xì)胞凋亡。我們在成功建立慢性氧中毒模型的基礎(chǔ)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)氫氣治療可以顯著減輕大鼠氧中毒后肺水腫程度及炎性滲出，并且氫氣治療可以有效緩解氧中毒引起的血氧水平下降。氫氣治療組顯著改善氧中毒引起的肺臟形態(tài)學(xué)破壞，抑制細(xì)胞凋亡。該部分

8、結(jié)果提示，氫氣飽和生理鹽水對慢性氧中毒具有保護作用。
　　其次，對保護機制進(jìn)行研究，以ASK1為入手點，對氫氣保護慢性氧中毒的機制進(jìn)行探討。
　　建立大鼠慢性氧中毒模型后，使用相應(yīng)方式進(jìn)行處理，提取肺組織總RNA和蛋白，分別采用Real time PCR和Western Blot檢測ASK1的mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果表明，與HALI組相比，氫氣干預(yù)組ASK1 mRNA水平和蛋白水平均顯著降低，結(jié)果提示，氫氣可通過抑制氧中

9、毒大鼠肺臟ASK1的基因表達(dá)和蛋白水平發(fā)揮慢性氧中毒保護作用。
　　最后，進(jìn)一步研究ASK1下游信號通路分子JNK及P38的表達(dá)變化，深入研究氫氣發(fā)揮保護作用的分子機制。提取肺組織總RNA和蛋白后，分別采用Real time PCR和Western Blot檢測JNK及P38的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧中毒后JNK和P38的表達(dá)均顯著上調(diào)，與HALI組相比，氫氣干預(yù)可以抑制JNK的mRNA表達(dá)，且pJNK蛋白水平顯著降低

10、，對于P38而言，與HALI組和氫氣干預(yù)組其mRNA和pP38蛋白水平均無顯著性差異。該結(jié)果表明，氫氣通過抑制ASK1的表達(dá)，從而抑制JNK通路而非p38MAPK通路發(fā)揮慢性氧中毒保護作用。
　　綜上所述，氫氣分子具有電中性、分子量小等特點，容易穿透細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)以及線粒體中，通過一系列實驗解釋了，氫氣可以顯著降低慢性氧中毒肺損傷，而氫氣的作用機制可能與抑制 ASK1-JNK信號通路密切相關(guān)，本課題初步揭示了氫氣保護效應(yīng)的分子機