慢性錳中毒誘導(dǎo)大鼠聽(tīng)覺(jué)損傷的研究.pdf

1、第一部分:慢性錳中毒對(duì)大鼠聽(tīng)力及耳蝸細(xì)胞形態(tài)的影響
　　目的:通過(guò)建立大鼠慢性錳中毒模型,研究錳中毒對(duì)大鼠聽(tīng)力及耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及線粒體融合蛋白2(mitochdrial fussion protein2,Mfn2)的表達(dá)變化的影響。
　　方法:隨機(jī)選取60只斷乳21天的SD大鼠,隨機(jī)分為染毒組和對(duì)照組,染毒組(30只)給予氯化錳水溶液(MnCl2·4H2O100mg/kg/d),連續(xù)灌胃12w,對(duì)照組(30只)

2、給予去離子水。分別于染毒4w、8w和12w檢測(cè)大鼠血錳濃度,于12w行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emissions,DPOAE)檢測(cè),基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素(Phalloidin-FITC)染色觀察毛細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù),HE染色觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù),通過(guò)透射電鏡(transmission

3、election microscopy,TEM)觀察毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)Mfn2在耳蝸基底膜和螺旋神經(jīng)元中的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:①大鼠染毒后,其血錳濃度隨時(shí)間逐漸增高,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②染毒12w大鼠4、8、16、24、32kHz ABR反應(yīng)閾明顯增高(P<0.05),其中高頻閾值提高顯著,DPOAE幅值降低。③基底膜鋪片F(xiàn)ITC染色示外毛細(xì)胞缺

4、失,其中以底回缺失明顯;螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞HE染色示染毒組細(xì)胞數(shù)量減少;透射電鏡下,可見(jiàn)染毒組毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞線粒體嵴斷裂或消失,呈空泡樣變;④Western blot結(jié)果示,染毒組基底膜和螺旋神經(jīng)元中Mfn2的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組。結(jié)論:慢性錳中毒可以引起大鼠耳蝸毛細(xì)胞缺失和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少,進(jìn)而導(dǎo)致大鼠聽(tīng)力損傷;耳蝸基底膜和螺旋神經(jīng)元中Mfn2表達(dá)增高,其作用機(jī)制還有待今后進(jìn)一步的研究。
　　第二部分:錳誘導(dǎo)體外螺旋

5、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGNs)凋亡的研究
　　目的:通過(guò)建立錳誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷體外模型,觀察錳中毒對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion cells,SGNs)形態(tài)的影響以及錳誘導(dǎo)SGNs凋亡過(guò)程中Bax蛋白的定位。
　　方法:采用原代分離培養(yǎng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,分為染毒組和正常對(duì)照組,染毒組的暴露時(shí)間分別為6h、12h和24h,給藥濃度為5mM氯化錳水溶液(MnCl2·4H2O),在倒置顯微鏡下觀察螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)

6、;利用β-tublin和Tunel試劑盒分別進(jìn)行SGNs鑒定和細(xì)胞凋亡檢測(cè);采用Mitotraker Green FM熒光探針標(biāo)記活體SGNs線粒體,通過(guò)免疫熒光染色觀察Bax的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象;在透射電鏡下觀察SGNs及其線粒體的超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果:①倒置顯微鏡下錳暴露6h:細(xì)胞胞間隙增大,細(xì)胞發(fā)生皺縮,軸突變短;錳暴露12h、24h:細(xì)胞胞間隙進(jìn)一步增大,突觸變短甚至消失,核固縮;②β-tublin和Tunel免疫熒光染色結(jié)果