轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β1對(duì)牛角膜基質(zhì)體外三維培養(yǎng)模型中膠原構(gòu)筑的影響.pdf

1、背景：膠原纖維結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因，包括角膜瘢痕形成。研究膠原纖維的構(gòu)筑，深入理解角膜瘢痕形成的分子機(jī)制，對(duì)尋找減少角膜瘢痕化及防治角膜盲具有重要意義。在角膜基質(zhì)損傷修復(fù)過(guò)程中，主要的病理性改變是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）纖維化，而ECM的異常沉積又以膠原纖維合成異常為主。體外三維培養(yǎng)克服了二維培養(yǎng)難以研究ECM結(jié)構(gòu)的局限性，是研究ECM的有效方法。我們的前期研究成功構(gòu)建了牛角膜基

2、質(zhì)細(xì)胞體外Pellet三維培養(yǎng)模型，添加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）于該模型中，可誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞在mRNA水平和蛋白水平上表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ，ColⅢ)、纖維鏈接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）。本研究應(yīng)用該培養(yǎng)體系探討TGF-β1對(duì)膠

3、原合成及構(gòu)筑的影響，進(jìn)一步理解角膜基質(zhì)瘢痕化的形成。
　　目的：構(gòu)建牛角膜基質(zhì)細(xì)胞體外Pellet三維培養(yǎng)模型，評(píng)估TGF-β1對(duì)該培養(yǎng)體系中角膜基質(zhì)細(xì)胞膠原纖維的合成情況（表達(dá)量及比例），及評(píng)估TGF-β1是否影響該模型新合成膠原的構(gòu)筑（直徑及空間排列）。
　　方法：利用體外Pellet三維培養(yǎng)模型培養(yǎng)原代牛角膜基質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)液添加TGF-β1質(zhì)量濃度不同，實(shí)驗(yàn)分為低濃度組(0.5 ng/ml TGF-β1)和高濃度組

4、(1.0 ng/ml TGF-β1)。于實(shí)驗(yàn)第2w、3w、4w時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達(dá);培養(yǎng)2w、4w時(shí)于透射電鏡下觀察膠原纖維的形態(tài)、走向及空間排列情況;同時(shí)應(yīng)用Image ProPlus6.0軟件測(cè)量ColⅠ和ColⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量，及4w時(shí)膠原纖維的直徑大小，并對(duì)其測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：(1)隨著TGF-β1濃度的增加或培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ColⅠ和ColⅢ蛋白的合成均逐漸

5、增加，具有濃度-相關(guān)性及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系;(2)無(wú)論是高濃度組還是低濃度組，ColⅢ/ColⅠ的比值均下調(diào)，呈時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì);且4w時(shí)ColⅢ/ColⅠ的比值顯著低于2w;各時(shí)間點(diǎn)相比較，高濃度組的比值低于低濃度組的。(3)透射電鏡圖片顯示在培養(yǎng)4w后膠原纖維大量合成，且排列紊亂，高濃度組較為明顯;(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果示4w時(shí)高濃度組纖維直徑明顯較低濃度組粗大，具有濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論：含0.5 ng/ml或1.0 ng/ml的