轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)犬穿透性角膜移植后免疫排斥的影響.pdf

1、目的:
　　 通過(guò)探究TGF-β1在犬穿透性角膜移植術(shù)(PKP)后在角膜中的表達(dá)變化規(guī)律并運(yùn)用TGF-β1蛋白滴眼液點(diǎn)眼，來(lái)探索TGF-β1對(duì)角膜免疫排斥反應(yīng)的影響。
　　 方法:
　　 (1)選取22只本地雜交犬隨機(jī)分為2組，分別為生理鹽水點(diǎn)眼組和供體組，每組9只，余下3只備用。PKP術(shù)后試驗(yàn)犬每日生理鹽水點(diǎn)眼4次，每次點(diǎn)2滴。每日裂隙燈觀察，根據(jù)Larkin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記錄免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間。
　　 (

2、2)選取35只本地雜交犬隨機(jī)分為2組，分別為生理鹽水點(diǎn)眼組，供體組，每組15只，余下5只備用。在生理鹽水點(diǎn)眼組試驗(yàn)犬PKP術(shù)后1d，3d，7d和14d使用RT-PCR方法測(cè)量角膜中TGF-β1的表達(dá)量變化。
　　 (3)選取59只本地雜交犬隨機(jī)分為3組，分別為TGF-β1點(diǎn)眼組，生理鹽水點(diǎn)眼組，供體組，每組18只，余下5只備用。TGF-β1點(diǎn)眼組于PKP術(shù)后每日點(diǎn)4次TGF-β1蛋白濃度為50ρ1/ml的滴眼液，每日3次，生理鹽

3、水組以相同點(diǎn)眼方式點(diǎn)眼生理鹽水，根據(jù)Larkin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記錄免疫排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間，并于術(shù)后3d，7d和14d，取角膜組織制作HE染色切片。
　　 試驗(yàn)結(jié)果:
　　 (1)生理鹽水試驗(yàn)組在角膜移植術(shù)后的第5d發(fā)生2例排斥反應(yīng)，術(shù)后第6d發(fā)生3例排斥反應(yīng)，術(shù)后第7d發(fā)生3例排斥反應(yīng)，術(shù)后8d發(fā)生1例排斥反應(yīng)，角膜植片免疫排斥反應(yīng)的平均時(shí)間為6.7±1.3天。
　　 (2)RT-PCR得到的數(shù)據(jù)處理采用相對(duì)定量的△△C

4、t法，根據(jù)各個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)試樣的CT值得到相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，以此比較。TGF-β1表達(dá)量在術(shù)后1d為2.4倍，術(shù)后3d為2.9倍，此時(shí)的表達(dá)量為整個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)中的最高峰值。TGF-β1表達(dá)量在術(shù)后3d以后呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，術(shù)后7d為0.75倍，直到術(shù)后14d為最低值0.5倍。
　　 (3)在TGF-β1液滴定術(shù)眼試驗(yàn)中，用生理鹽水滴眼的對(duì)照組，在角膜移植術(shù)后的5d發(fā)生兩例排斥反應(yīng)，術(shù)后6d發(fā)生4例排斥反應(yīng)，術(shù)后7d發(fā)生5例排

5、斥反應(yīng)，術(shù)后8d發(fā)生3例排斥反應(yīng)，最后兩例于術(shù)后第9d發(fā)生。使用TGF-β1蛋白滴眼液的實(shí)驗(yàn)組于角膜移植術(shù)后11d發(fā)生第一例排斥反應(yīng)，術(shù)后12d發(fā)生一例排斥反應(yīng)，術(shù)后13d發(fā)生3例排斥反應(yīng)，術(shù)后14d發(fā)生5例排斥反應(yīng)，術(shù)后15d發(fā)生3例排斥反應(yīng)，術(shù)后17d發(fā)生一例排斥反應(yīng)，最后一例排斥反應(yīng)發(fā)生于術(shù)后19d。TGF-β1蛋白滴眼液點(diǎn)眼的試驗(yàn)組的角膜植片存活的平均時(shí)間為13±2.1d，使用生理鹽水點(diǎn)眼的對(duì)照組的角膜移植片存活平均時(shí)間為7±1

6、.3d，試驗(yàn)組角膜植片的存活時(shí)間很顯著的長(zhǎng)于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.01)。
　　 (4)使用裂隙燈對(duì)穿透性角膜移植術(shù)后的植片進(jìn)行臨床觀察并拍照記錄，PKP術(shù)后3d觀察角膜植片，生理鹽水對(duì)照組的植片出現(xiàn)輕度的角膜水腫，裂隙燈光能透射前房，TGF-β1蛋白滴眼液點(diǎn)眼試驗(yàn)組的植片均呈現(xiàn)比較好的透明度，植片周圍的植床呈現(xiàn)輕度的角膜水腫，裂隙燈光能透射前房。兩組均未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。PKP術(shù)后7d觀察角膜植片，生理鹽水對(duì)照組的植片有1

7、1例已經(jīng)完全失去透明度，角膜嚴(yán)重增厚，植片周圍有新生血管爬行。TGF-β1蛋白滴眼液試驗(yàn)組的角膜植片呈現(xiàn)中度水腫，裂隙燈光部分能透射前房，縫合處有少量新生血管爬行，試驗(yàn)組尚未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。PKP術(shù)后14d，生理鹽水對(duì)照組所有植片重度水腫，植片完全失去透明度。TGF-β1蛋白滴眼液試驗(yàn)組的植片有10例發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，裂隙燈光無(wú)法穿透前房，瞳孔尚可見，角膜重度水腫。生理鹽水對(duì)照組術(shù)后3d的組織切片觀察可見，內(nèi)皮層有部分缺失，基質(zhì)

8、膠原細(xì)胞排列有序，基質(zhì)層輕度水腫，上皮層略有損傷。術(shù)后7d的組織切片觀察可見，內(nèi)皮層脫落，基質(zhì)層中度水腫，上皮層部分缺失或脫離基質(zhì)層。術(shù)后14d的組織切片觀察可見，內(nèi)皮層完全脫落，后彈力層部分缺失，上皮層部分缺失，基質(zhì)層嚴(yán)重水腫;TGF-β1試驗(yàn)組術(shù)后3d的組織切片觀察可見，角膜上皮細(xì)胞完成，排列有序，基質(zhì)層無(wú)明顯水腫，內(nèi)皮細(xì)胞完整。術(shù)后7d，內(nèi)皮細(xì)胞仍然附著于后彈力層但內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少，上皮層完成，上皮細(xì)胞排列有序。術(shù)后14d，內(nèi)皮細(xì)