雌激素、胰島素樣生長因子-Ⅰ對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞的影響.pdf

1、隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，對生長板軟骨細(xì)胞在體內(nèi)和體外的研究也越來越深入。國內(nèi)外大量的研究人員利用定量活體標(biāo)記技術(shù)對哺乳類動物（包括人類）、嚙齒類動物、禽類及野生動物如蝙蝠等不同種屬動物的生長板生長、發(fā)育，病變發(fā)生、損傷修復(fù)機(jī)制和軟骨內(nèi)成骨過程等領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛而深入的研究。鑒于雞胚四肢骨骼是研究骨骼發(fā)育較為理想的模型之一，同時為了更深入研究生長板軟骨發(fā)育不良相關(guān)疾病，如肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（tibial dyschondroplasia

2、，TD），有必要對肉雞脛骨生長板軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過對獲得的生長板軟骨細(xì)胞在體外的生長及發(fā)育特征以及對生長板軟骨的全身和局部調(diào)節(jié)因子如雌激素和胰島素樣生長因子-Ⅰ對其增殖和分化的影響的研究，為肉雞脛骨軟骨生長板軟骨發(fā)育不良等疾病的深入研究，以及人類和其它動物的軟骨體外修復(fù)，提供借鑒。
　　 試驗一、雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：建立雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞的高效分離法，并對其進(jìn)行鑒定。方法：設(shè)計

3、以1 mg·ml-1的Ⅱ型膠原酶兩步消化法，分離制備脛骨生長板軟骨細(xì)胞，觀察其對12～20胚齡雞脛骨生長板軟骨細(xì)胞的分離效果；采用不同的染色方法，在倒置顯微鏡和光鏡下觀察體外培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。結(jié)果：（1）Ⅱ型膠原酶兩步消化可使生長板軟骨基質(zhì)完全解離降解，細(xì)胞均分離，細(xì)胞存活率達(dá)90％以上；（2）前兩代細(xì)胞貼壁生長呈圓形或多角形，單個鋪開時體積較大，生長匯合時呈卵圓形，Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍(lán)（TB）異染反應(yīng)均呈陽性；第4

4、代以后細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，Ⅱ型膠原免疫組化染色減弱，TB異染反應(yīng)陰性；（3）前三代軟骨細(xì)胞長期培養(yǎng)下去，能逐漸匯合，并形成軟骨塊狀組織，堿性磷酸酶染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色強(qiáng)陽性，甲苯胺藍(lán)染色異染反應(yīng)較強(qiáng)，茜素紅染色能觀察到鈣化結(jié)節(jié)。結(jié)論：采用兩步Ⅱ型膠原酶消化分離雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞，具有細(xì)胞收獲率、細(xì)胞存活率高、操作簡便等特點(diǎn)；隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，生長板軟骨細(xì)胞出現(xiàn)去分化，逐漸失去軟骨細(xì)胞的特異性表型；軟骨細(xì)胞若有合適附著基質(zhì)

5、，長期培養(yǎng)下去能保持較強(qiáng)的成骨能力。
　　 試驗二、雌激素對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞增殖分化的影響
　　 目的：在建立雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，研究雌激素對雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長狀態(tài)良好的第二代軟骨細(xì)胞接種于96孔板，添加不同濃度的雌激素，分別用MTT法、PNPP法測定軟骨細(xì)胞增殖率和軟骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性，用全自動生化分析儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣

6、、磷、ALP含量。結(jié)果：（1）36 h，54 h，25～1600 pg·mL-1的雌激素均顯著促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖（P<0.01）。其中，作用54 h，200，400，800 pg·mL-1的雌激素促增殖作用顯著；（2）54 h，400、800 pg·mL-1的雌激素顯著促進(jìn)生長板軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P<0.01），1600 pg·mL-1的雌激素則顯著抑制軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P<0.01）；（3）細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣濃度：在36 h，4

7、00、800 pg·mL-1雌激素作用下，明顯降低，18 h，400 pg·mL-1，明顯升高，54 h，隨雌激素的濃度增加而增加；磷濃度：400、800 pg·mL-1雌激素作用下，在各個時間段都處于較高的水平；ALP活性：在18 h，對照組和800 pg·mL-1含量較高，36 h，100、200、800 Pg·mL-1明顯降低，54 h，隨濃度的增加，各組ALP呈下降趨勢。結(jié)論：雌激素能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖；使軟骨細(xì)胞內(nèi)的ALP

8、顯著增加；但濃度越大，則呈現(xiàn)明顯的抑制作用；細(xì)胞培養(yǎng)液中鈣、磷隨培養(yǎng)時間延長而增高，ALP則隨時間增加而降低。
　　 試驗三、胰島素樣生長因子-Ⅰ對體外培養(yǎng)雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞增殖分化的影響
　　 目的：在建立雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，研究重組IGF-Ⅰ對雞胚脛骨生長板軟骨細(xì)胞增殖、分化和代謝功能的影響。方法：取生長狀態(tài)良好的第二代軟骨細(xì)胞于96孔板上進(jìn)行重組IGF-Ⅰ作用下，用MTT法測定軟骨細(xì)胞增

9、殖率，PNPP法測定軟骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性，并用全自動生化分析儀測定體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣、磷及ALP含量。結(jié)果：（1）在36 h，10、15、20 ng·mL-1的IGF-Ⅰ使軟骨細(xì)胞增殖受到抑制（P<0.01），隨作用時間的增加各種濃度作用下的軟骨細(xì)胞，均有增殖，但差異不顯著；（2）在36 h，10、20、40 ng·mL-1的IGF-Ⅰ可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P<0.01）。54 h，20、40 ng·m

10、L-1的IGF-Ⅰ可顯著促進(jìn)生長板軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性（P<0.01）；（3）軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的鈣、磷隨IGF-Ⅰ濃度的增加而減少，隨培養(yǎng)時間延長，其濃度有所增加。在18 h，10 ng·mL-1的IGF-I抑制了生長板軟骨培養(yǎng)液中ALP的活性，20、40 ng·mL-1的IGF-Ⅰ促進(jìn)了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP的活性。隨培養(yǎng)時間的延長，ALP活性下降。結(jié)論：IGF-Ⅰ不能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖；但能顯著增加軟骨細(xì)胞內(nèi)ALP的活性；隨培養(yǎng)