小鼠皮層內(nèi)移植膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能重建研究.pdf

1、目的:星形膠質(zhì)細(xì)胞是人類大腦中分布最廣泛的細(xì)胞。其與神經(jīng)元和腦血管形成重要的連接，參與調(diào)節(jié)血流，并幫助神經(jīng)元處理各種感覺信息。研究表明，感覺刺激引起大腦神經(jīng)元活動(dòng)的同時(shí)，還能夠引起神經(jīng)元周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)。另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞還可通過釋放谷氨酸，參與調(diào)控神經(jīng)元活動(dòng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能性紊亂會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物及人類出現(xiàn)神經(jīng)和精神性疾病。因此，膠質(zhì)細(xì)胞移植治療可能成為一種治愈神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效手段。之前大量動(dòng)物研究證實(shí)，移植膠質(zhì)前體細(xì)胞或者星

2、形膠質(zhì)細(xì)胞可以改善患病動(dòng)物的大腦功能，提高動(dòng)物行為能力。然而，目前尚缺乏活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)，證實(shí)移植的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠整合入宿主的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而發(fā)揮功能?；诖?，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用雙光子顯微鏡并聯(lián)合足底痛覺刺激，在活體動(dòng)物水平，對小鼠大腦皮層移植的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞水平的在體功能研究。并通過光鏡聯(lián)合雙束掃描電鏡技術(shù)，對移植星形膠質(zhì)細(xì)胞與宿主神經(jīng)元痛覺傳導(dǎo)環(huán)路的整合進(jìn)行了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察和重構(gòu)。
　　方法:①分離孕14.5天～15.5天EGF

3、P胎鼠端腦的神經(jīng)干細(xì)胞，并將其誘導(dǎo)為膠質(zhì)前體細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞。分別用免疫熒光和共聚焦鈣成像的方法，對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞、以及由其分化而來的膠質(zhì)前體細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的鑒定。②將以上誘導(dǎo)得到的膠質(zhì)前體細(xì)胞移植入成年小鼠大腦體感皮層，采用免疫組織熒光化學(xué)和雙光子成像的方法，對移植后不同時(shí)間點(diǎn)(4W，8W，12W，25W，45W)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。③應(yīng)用雙光子顯微鏡對移植后不同時(shí)間點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行在體

4、鈣成像觀察，并對痛覺介導(dǎo)的移植星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鈣成像記錄。④應(yīng)用光鏡聯(lián)合雙束掃描電鏡技術(shù)，對移植星形膠質(zhì)細(xì)胞與基底核(NBM)膽堿能神經(jīng)元的軸突投射，進(jìn)行細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平研究。
　　結(jié)果:①分化培養(yǎng)基(DMEM/F12+B27+10 ng/mL CNTF+30％ FBS)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)前體細(xì)胞的分化率為87％，向成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞分化率為83％，并且ATP及Thapsigargin能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生鈣

5、活動(dòng)。②膠質(zhì)前體細(xì)胞移植入成年小鼠的大腦皮層內(nèi)，12W后可分化為成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且在腦內(nèi)存活至少45W。③移植后12W的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有自發(fā)鈣活動(dòng)，且鈣反應(yīng)幅度與宿主星形膠質(zhì)細(xì)胞類似。從移植后12W開始，移植星形膠質(zhì)細(xì)胞可以對痛覺刺激產(chǎn)生相應(yīng)的鈣反應(yīng)活動(dòng)，痛覺刺激誘發(fā)移植星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣反應(yīng)潛伏期及反應(yīng)幅度均與宿主星形膠質(zhì)細(xì)胞類似。④光鏡結(jié)果顯示基底核(NBM)膽堿能神經(jīng)元的軸突投射至大腦皮層的軸突末梢可與移植星形膠質(zhì)細(xì)胞突起上的α

6、7-N型乙酰膽堿受體（α7-nAchR)相互靠近。⑤電鏡結(jié)果顯示，移植星形膠質(zhì)細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)可以與來自NBM的宿主神經(jīng)元投射形成“三突觸”或者“突觸樣”結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:①CNTF及FBS可以體外誘導(dǎo)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞向成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，分化而來的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)，具有類似于正常細(xì)胞的ATP受體以及胞內(nèi)鈣庫系統(tǒng)。②胚胎干細(xì)胞來源的膠質(zhì)前體細(xì)胞移植入成年小鼠的大腦皮層后可在形態(tài)上逐漸發(fā)育成熟，并于移植后12W顯示出成熟膠質(zhì)細(xì)胞

7、的形態(tài)。③移植星形膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠大腦皮層內(nèi)具有自發(fā)鈣活動(dòng)，并可以對痛覺刺激做出反應(yīng)，提示移植星形膠質(zhì)細(xì)胞已在功能上整合入宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。④來自NBM區(qū)膽堿能神經(jīng)元軸突投射末梢可與移植星形膠質(zhì)細(xì)胞突起形成“三突觸”和“突觸樣”結(jié)構(gòu)，提示移植膠細(xì)胞可在結(jié)構(gòu)上整合進(jìn)入宿主神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。
　　綜上所述，胚胎干細(xì)胞來源的膠質(zhì)前體細(xì)胞移植入成年小鼠大腦皮層后，能夠分化、發(fā)育為成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，并在結(jié)構(gòu)與功能上整合入宿主動(dòng)物皮層的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，參與神