高雌激素對胎盤滋養(yǎng)細胞緊密連接功能的影響.pdf

1、目的:
　　IVF周期中大劑量促排卵藥物使用后多卵泡同時發(fā)育所產生的超生理劑量的雌激素水平被認為和ART不良妊娠結局密切相關。實驗室前期研究發(fā)現ART來源胎盤緊密連接功能異常，由此推測IVF周期高雌激素可能通過胎盤緊密連接進而影響滋養(yǎng)細胞侵襲能力，引發(fā)相關妊娠合并癥。前期實驗室已建立滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)模型，通過免疫熒光開展了滋養(yǎng)細胞緊密連接因子的表達和定位研究，并通過跨上皮電阻和細胞旁滲透性的測定實現了緊密連接功能的評估。本研究檢測

2、正常自然妊娠女性妊娠早期和足月分娩時外周血、絨毛組織或胎盤組織中雌二醇(E2)水平以及足月分娩時臍動脈血E2水平;擬探討生理和超生理濃度雌激素對滋養(yǎng)細胞緊密連接功能及侵襲能力的影響;進一步研究IVF超生理雌激素水平和不良妊娠結局關聯，為優(yōu)化ART條件、提高ART技術安全性提供新的依據。
　　方法:
　　(1)本研究納入20例非意愿妊娠行妊娠早期流產者、20例足月妊娠行剖宮產者，采用化學發(fā)光免疫分析(CLLA)檢測妊娠早期流產

3、絨毛組織、孕婦外周血以及分娩時孕婦外周血、臍動脈血和胎盤組織中E2水平。
　　(2)利用Millicell小室系統培養(yǎng)BeWo細胞，建立體外滋養(yǎng)層細胞單層培養(yǎng)模型。
　　(3)利用不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細胞一定時間(1h、3h、6h、12h、24h)后，分別通過測定細胞跨上皮電阻(Transepithelial electrical resi

4、stance，TEER)和細胞旁滲透性的改變(Paracellular permeability，CPP)的改變，評估雌激素作用下滋養(yǎng)層緊密連接功能的改變。
　　(4)確定處理BeWo細胞12小時的選擇，該時間點作用BeWo細胞能最大程度反映雌激素處理細胞后改變。通過Western Blot檢測緊密連接因子ZO-1、OCLN、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN8在不同濃度17β-E2處理12h后蛋白水平表達改變。

5、　　(5)利用免疫熒光技術檢測一定濃度的17β-E2處理BeWo細胞12h后緊密連接因子細胞定位的變化，研究雌激素對緊密連接功能改變的可能原因。
　　(6)體外培養(yǎng)BeWo細胞，CCK-8實驗檢測不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細胞12h后細胞活力改變，確定該條件的選擇可以用于后續(xù)的BeWo細胞侵襲實驗。
　　(7)利用以上實驗條件，細胞體外侵襲實驗(

6、Transwell Matrigel Invasion Assay)檢測細胞侵襲能力的改變。并進一步通過Western Blot檢測基質金屬蛋白酶2和9(MMP2、MMP9)的表達，探討高雌激素導致滋養(yǎng)層細胞侵襲能力受損的可能原因。
　　結果:
　　(1)妊娠早期的孕婦血清E2濃度[（3.44±1.30）nmol/L]低于足月妊娠孕婦[（509.78±197.82）nmol/L](t=10.2，P＜0.001);而孕早期絨毛

7、組織中E2濃度[（30.82±13.91）pmol/mg]顯著高于足月胎盤組織中E2濃度[（17.21±5.37)pmol/mg](t=4.1,P＜0.001)）。
　　(2)利用Millicell小室體外培養(yǎng)BeWo細胞，通過TEER測定和CPP分析評估不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)雌激素對滋養(yǎng)層細胞作用不同時間后，對其緊密連接功能的影響。結果顯示不同濃度17β-E2處理BeW

8、o細胞1h和3h后，其TEER均無明顯變化(P＞0.05);5×10-7M、5×10-8M的17β-E2處理BeWo細胞6h后，其TEER顯著降低，CPP顯著升高（P＜0.05）;
　　(3)5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M的17β-E2處理BeWo細胞12h和24h后，其TEER顯著降低，CPP顯著升高(P＜0.05)。其中在12h，17β-E2對BeWo的處理效應最為明顯，且呈現一定的濃度依賴性。
　　(4

9、)不同濃度17β-E2作用BeWo細胞12h后Western Blot檢測各緊密連接因子蛋白水平的表達，發(fā)現OCLN在5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M雌激素水平表達量下調（P＜0.05）;CLDN3在5×10-7M、5×10-8M雌激素水平表達量下調(P＜0.05);其他緊密連接因子表達量無明顯改變(P＞0.05)。5×10-7M17β-E2處理BeWo細胞12h后，免疫熒光結果顯示OCLN和CLDN3表達量下調，CLDN

10、5呈現出從胞漿轉移至胞核的現象。
　　(5)體外培養(yǎng)BeWo細胞，CCK-8實驗檢測不同濃度(0M、5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo細胞12h，細胞活力沒有明顯改變(P＞0.05)。
　　(6)細胞體外侵襲實驗顯示僅5×10-7M、5×10-8M雌激素作用BeWo細胞12后，BeWo細胞侵襲能力下降;Western Blot結果顯示同等條件下MMP2表達下調(P＜0.

11、05)，MMP9無明顯改變(P＞0.05)。
　　結論:
　　(1)正常自然妊娠的早期絨毛組織中含有高濃度的E2，足月分娩時胎盤組織中E2相對較低。
　　(2)本研究以BeWo細胞為模型，發(fā)現高水平雌激素可引起滋養(yǎng)層細胞緊密連接功能的破壞，提示ART促排產生的高雌激素水平可能會通過影響滋養(yǎng)層細胞間緊密連接結構進而影響胎盤功能的正常發(fā)揮。
　　(3)高水平雌激素可以導致BeWo細胞侵襲功能受損，提示ART促排產生的