與石房蛤毒素特異結合的適配體的優(yōu)化及其驗證.pdf

1、石房蛤毒素(STX)是麻痹性貝類毒素家族中的一員，由海洋藻類合成后，通過食物鏈作用富集于甲殼類和軟體動物體內(nèi)，經(jīng)人類和海洋動物食用后產(chǎn)生麻痹性貝類中毒。該毒素主要通過阻斷可興奮細胞表面的鈉離子通道產(chǎn)生毒性效應。為了保證人類的健康不受威脅，對STX進行檢測尤為重要。然而，STX的檢測，尤其是快速檢測中，最關鍵的部分是STX的分子識別元件。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)篩選出來的能夠與多種靶分子如藥物，蛋白質(zhì)，其他

2、無機或有機分子高親和力高特異性地結合的一小段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。相對于抗體，它有著多種自身優(yōu)勢，包括其穩(wěn)定性，低免疫原性，易于自動化學合成等，已作為分子識別元件應用于靶分子檢測，疾病診斷，疾病治療等多方面。為了找到候選的STX分子識別元件，先前Handy等人已經(jīng)通過SELEX技術篩選出一條DNA適配體，APTSTX1。然而，它的動力學參數(shù)，關于功能的研究以及篩選后的優(yōu)化都沒有得到相關報道，這些對于改善其特性從而更好地應用都是

3、必要的。
　　由于PCR的擴增偏性和實驗操作導致的文庫多樣性降低等原因，一些與靶分子高親和力結合的適配體無法通過SELEX技術篩選出來。多個團隊成功地通過突變的方法對已經(jīng)篩選得到的適配體進行優(yōu)化，并獲得比原始序列親和力更高卻未被篩選出來的序列。本研究中，采用類似的方法，在理性分析的基礎上對APTSTX1進行突變，期望得到潛在的具有更高親和力的適配體。G-四聯(lián)體是一種高度有序高穩(wěn)定性的核酸空間結構，如果經(jīng)過突變適配體能夠形成G-四聯(lián)

4、體結構，則可能會與靶分子結合地更緊密，表現(xiàn)出更高的親和力。因此，設計了多條突變序列（包括單點突變及多點突變），將鳥嘌呤核苷酸任一端或兩端的核苷酸也突變?yōu)轼B嘌呤核苷酸，因為鳥嘌呤核苷酸為G-四聯(lián)體結構所必需。借助QGRS Mapper軟件進行結構預測，將可能折疊成G-四聯(lián)體結構的序列進行合成并采用生物膜干涉的方法進行親和力測定。其中部分序列與APTSTX1相比親和力得到提高，而親和力最高的是M-30，比APTSTX1提高了30倍。在此基礎

5、上，對M-30進一步截短，分別將兩端的游離序列和四個莖-環(huán)結構逐個移除，并進行親和力測定。通過對這些截短序列的結構與親和力之間的關系進行分析，發(fā)現(xiàn)其結合STX的核心序列是5'端的兩個莖-環(huán)結構。將其他多余的核苷酸移除后，得到M-30f，通過生物膜干涉的方法測得其Kd值為133nM，與M-30相比親和力并未明顯下降。最后，通過多種方法（ELISA，細胞生物學分析和小鼠生物檢測），對優(yōu)化前后的兩條適配體(APTSTX1及M-30f)進行了親

6、和力比較，并對它們的STX抑制活性進行了評價。兩條適配體與STX結合的能力在三種方法中都得到驗證。ELISA和細胞生物學測定的結果表明，STX與APTSTX1、M-30f的相互作用間存在顯著的統(tǒng)計學差異，M-30f的結合能力更強，并且兩條適配體均可以拮抗STX的鈉離子通道抑制活性，而M-30f的抑制效果更好。
　　總之，優(yōu)化后的序列，M-30f，性能優(yōu)于其母序列。作為STX的分子識別元件，M-30f具有更好的實際應用前景。此外，理