海洋聚醚類毒素基于適配體的檢測(cè)及生物合成的探索.pdf

1、海洋聚醚類毒素結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜，毒性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，在全球分布廣泛。多來(lái)源于容易形成赤潮的有毒甲藻，通過(guò)食物鏈在貝類、魚(yú)類等海產(chǎn)品體內(nèi)富集，對(duì)于人類健康和海洋漁業(yè)造成了嚴(yán)重威脅?，F(xiàn)有的毒素檢測(cè)方法都存在各種各樣的不足，因此急需新型的快速檢測(cè)聚醚類毒素的方法。此外，由于天然海洋聚醚類毒素提取困難，甲藻基因組又很難解析，因此目前對(duì)于毒素的生物合成了解的比較匱乏。
　　本課題以海洋聚醚類毒素中代表性的短裸甲藻毒素BTX、巖沙海葵毒素PLTX和

2、大田軟海綿酸OA為研究對(duì)象，從毒素的檢測(cè)和生物合成兩方面展開(kāi)研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.海洋聚醚類毒素BTX適配體的篩選與應(yīng)用。采用體外SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)18輪的篩選富集，分別獲得了與海洋聚醚類毒素BTX-A和BTX-B特異性結(jié)合的高親和力適配體A5和B2。通過(guò)先混合靶標(biāo)篩選后分開(kāi)次級(jí)文庫(kù)篩選的方式，一次性獲得了兩種毒素同系物的適配體，建立了一種高效篩選同系物適配體的SELEX方法。在此基礎(chǔ)上A5和B2這兩個(gè)適配體序列

3、進(jìn)行了截短優(yōu)化和突變改造?；趍fold軟件對(duì)該適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，截去A5引物區(qū)及5'端第一個(gè)莖環(huán)，并進(jìn)一步進(jìn)行了非必須核苷酸的去除和突變，獲得僅含有32個(gè)核苷酸的核心序列A5-S3G(Kd=72nM)。且不與STX、GTX、BTX-B、PLTX、OA等毒素結(jié)合，具有較好的特異性。通過(guò)生物素-鏈霉親合素耦合在線制備了基于SSA芯片和BLI技術(shù)的適配體傳感器，建立了基于生物膜干涉適配體傳感器檢測(cè)BTX的方法。最佳檢測(cè)時(shí)間250 s

4、，檢測(cè)范圍為100～2000 nM，最低檢測(cè)限4.5 nM(4 ng/ml)，且無(wú)交叉反應(yīng)，同時(shí)具有較低的變異系數(shù)，可用于BTX-A的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
　　2.海洋聚醚類毒素PLTX適配體的篩選與優(yōu)化。采用體外SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)10輪的篩選富集，通過(guò)序列同源比對(duì)聚類分析，結(jié)合生物膜干涉技術(shù)對(duì)篩選得到的若干適配體序列進(jìn)行親和力表征，獲得了6條與海洋聚醚類毒素PLTX特異性結(jié)合的高親和力適配體，適配體P-13親和力最高（Kd=0.9 nM

5、）。在此基礎(chǔ)上，對(duì)P-5、P-13和P-18三條適配體序列進(jìn)行了截短優(yōu)化。基于mfold二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，截去引物區(qū)及非必須核苷酸，獲得了2段與PLTX高親和力結(jié)合的核心序列，P-13S2(Kd=0.56 nM)和P-18S2(Kd=0.93nM)，為PLTX生物傳感器的制備奠定了基礎(chǔ)，提供了識(shí)別元件。將PLTX通過(guò)氨基偶聯(lián)到SPR CM5生物芯片表面，并用該芯片對(duì)優(yōu)化后的序列進(jìn)行親和力表征，結(jié)合優(yōu)化后的序列及SPR技術(shù)，該芯片可用于制備

6、高靈敏的競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)PLTX的生物傳感器。
　　3.基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的OA生物合成相關(guān)基因的挖掘。選取了初始氮濃度:磷濃度分別為15:1和30:1的培養(yǎng)條件培養(yǎng)利瑪原甲藻P.lima，培養(yǎng)不同時(shí)間收集藻細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和de novo拼接，得到了98594個(gè)Unigene，其平均長(zhǎng)度為1319nt，N50為1856 nt。得到的轉(zhuǎn)錄本通過(guò)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)、COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋及分類，通過(guò)

7、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)代謝途徑注釋，其中73289個(gè)Unigene成功注釋到功能，注釋到333條代謝途徑。在此基礎(chǔ)上初步確定了代謝途徑中基因的上調(diào)及下調(diào)水平。最后利用RSEM計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的RPKM值，并對(duì)相關(guān)代謝途徑中的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)差異進(jìn)行了初步分析。在此基礎(chǔ)上初步解析了OA生物合成相關(guān)的重要基因，如編碼PKS、硫脂酶、黃素單加氧酶、環(huán)氧化酶、環(huán)氧化物水解酶、細(xì)胞色素P450等酶的基因在不同樣品中表達(dá)量的差異。
　　綜上，本研究

8、分別篩選出了能與BTX和PLTX高親和力、特異性結(jié)合的適配體，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改造，成功制備了基于生物膜干涉技術(shù)的快速檢測(cè)BTX的適配體傳感器，獲得了能夠開(kāi)發(fā)用于PLTX檢測(cè)的SPR芯片和適配體識(shí)別元件，對(duì)于聚醚類毒素檢測(cè)提供了新的方法和工具。此外，實(shí)現(xiàn)了對(duì)利瑪原甲藻P.lima的轉(zhuǎn)錄組解析，并比較了不同營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)不同時(shí)間利瑪原甲藻的基因的表達(dá)差異，在此基礎(chǔ)上初步解析了OA生物合成相關(guān)的重要基因的差異表達(dá)，對(duì)進(jìn)一步闡明OA的生物合成途