小G蛋白Rac1及其上游調控分子OCRL1在骨關節(jié)炎疾病發(fā)展及治療中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Rac1在軟骨細胞肥大鈣化及骨關節(jié)炎病理中的作用研究
　　目前一種普遍認同的理論認為，在骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的發(fā)生過程中，關節(jié)表面軟骨細胞發(fā)生了類似于軟骨發(fā)育中的軟骨內成骨(EndochondralOssification)過程，導致了軟骨細胞的病理性肥大、鈣化(Hypertrophy andCalcification)，最后導致軟骨層遭到破壞。Rac

2、1(ras-Related C3 Botulinum ToxinSubstrate1)是烏苷三磷酸酶(guanosine triposphatase，GTP)家族中的重要成員，具有Rho類型的GTP酶結合區(qū)，與GTP和二磷酸鳥嘌呤核苷(guanosine diphosphate，GDP)有高度親和性，與GDP結合時失活，與GTP結合時激活。在C57小鼠的軟骨中特異性敲除Rac1，會導致軟骨內成骨過程受阻，肢體發(fā)育變短;體外軟骨細胞中，R

3、ac1的過度表達會促進軟骨細胞肥大標志COLX promoter的活性升高，提示Rac1在軟骨發(fā)育過程中有促進軟骨細胞肥大、鈣化的作用。然而，Rac1在軟骨細胞的病理性肥大、鈣化作用，以及骨關節(jié)炎疾病發(fā)展中作用的研究仍然較為缺乏。
　　本研究首次檢測了OA軟骨樣本及正常軟骨樣本中Rac1總表達量、活性的區(qū)別。我們首先發(fā)現(xiàn)，OA軟骨中Rac1活性異常升高，提示Rac1可能參與OA疾病的發(fā)展。為了驗證Rac1在OA中的作用，我們通過前

4、交叉韌帶和半月板切除術(ACLT)構建了小鼠OA模型，同時構建了Rac1過度激活和Rac1失活兩種病毒載體，體外包裝病毒并濃縮，通過關節(jié)腔注射病毒濃縮液改變關節(jié)軟骨局部Rac1活性。術后8周對軟骨的組織學檢測發(fā)現(xiàn)，Rac1活性升高顯著促進軟骨基質降解，促進基質降解酶MMP13、ADAMTS-5的分泌以及軟骨肥大鈣化標志COLX和Runx2的表達。反之，降低Rac1的活性顯著減緩OA的發(fā)生。體外的機制研究表明，Rac1激活能夠促進軟骨細胞

5、病理性的肥大、鈣化，而這種作用是通過促進β-catenin核內轉運介導的。
　　第二部分 Rac1上游調控因子RhoGAP---OCRL1在調控Rac1活性及軟骨鈣化中的作用研究
　　第一部分研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OA軟骨細胞中Rac1的活性異常升高，由于Rac1屬于小G蛋白家族，其活性的高低受細胞內一些專門的上游調控因子調控。如鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)能夠提高小

6、G蛋白活性，GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)能夠降低小G蛋白活性。因此，我們推測軟骨中某些GEF的上調或者某些GAP的下調導致了Rac1的活性的異常升高。
　　通過熒光定量PCR檢測，我們比較了正常關節(jié)軟骨組織和骨關節(jié)炎病變軟骨組織中20個GEF基因和8個GAP基因的表達差異。結果顯示，在這些組織中，20個GEF因子的表達沒有顯著性升高，而我們所檢測的GAP蛋白中，OCRL1是唯一一個

7、有顯著性下降的GAP基因。體外軟骨鈣化模型中，當向軟骨細胞中轉入外源性OCRL1質粒后，通過堿性磷酸酶染色(ALP)及其灰度定量可以發(fā)現(xiàn)，IL1β、TGFα和TNFα促進軟骨細胞鈣化的作用被明顯抑制。相反的，當用小干擾RNA(siRNA)敲降OCRL1后，IL1β、TGFα和TNFα引起的軟骨細胞的鈣化作用會被加強。軟骨細胞中過表達OCRL1能夠阻斷ILβ導致Rac1的過度激活。相反的，siRNA敲降OCRL1能夠進一步提高軟骨細胞中R

8、ac1的活性。分段克隆OCRL1RhoGAP domain和非RhoGAP domain分別過表達于軟骨細胞中并檢測對軟骨細胞病理變化的影響，發(fā)現(xiàn)OCRL1對軟骨細胞的Rac1活性調節(jié)是通過其上的RhoGAPdomain起作用的。最后，我們研究了體內OCRL1在小鼠ACLT造成的OA疾病發(fā)展中的作用。GFP對照和OCRL1慢病毒包裝后，經(jīng)濃縮后關節(jié)腔內注射。術后6周，外源性的GFP和HA檢測證實病毒成功感染小鼠關節(jié)表面軟骨，同時Rac1

9、的活性隨著外源性OCRL1的轉入顯著降低。Safranin Orange組織學染色結果可以看到，GFP對照小鼠的關節(jié)表現(xiàn)出典型OA病理改變，如軟骨基質染色變淺，軟骨產(chǎn)生明顯缺損。而OCRL1組小鼠的關節(jié)軟骨保存較為完整，軟骨基質染色顏色也較深，只有在脛骨平臺靠近內側半月板的部分軟骨，表面有纖維狀軟骨出現(xiàn)。同時對比GFP組，OCRL1組關節(jié)軟骨表達更少的MMP13、ADAMTS-5和COLX。
　　第三部分 靶向Rac1的骨關節(jié)炎治

10、療及骨軟骨缺損修復研究
　　最后，為了更好的靶向Rac1干預骨關節(jié)炎發(fā)展，該研究創(chuàng)新地運用殼聚糖微球包裹Rac1小分子抑制劑NSC23766，在關節(jié)腔內進行緩釋。我們分別在小鼠ACLT關節(jié)不穩(wěn)定OA模型和大鼠關節(jié)軟骨缺損修復兩種動物模型中，檢測了Rac1殼聚糖緩釋微球的潛在治療作用。
　　小鼠OA術后4周、6周和8周的樣本組織學檢測表明，OA關節(jié)腔內注射包裹NSC23766微球可以顯著降低軟骨細胞中Rac1活性，同時抑制軟骨