SR-BⅠ拮抗經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)的S1P-S1PR2介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的促炎作用.pdf

1、[背景與目的]內(nèi)皮功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的重要始動環(huán)節(jié)，氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein ox-LDL)可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血管壁炎癥并加速動脈粥樣硬化病變。HDL-S1P的血管內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)主要是通過S1 P與不同亞型的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合所產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。已有研究證明S1PR2在內(nèi)皮細(xì)胞中是致動脈粥樣硬化的作用，但是與高密度脂蛋白結(jié)合的S1PR2最終沒有表現(xiàn)出致動脈

2、粥樣硬化的作用。HDL高親和受體SR-B I和HDL-S1P通過共同的細(xì)胞內(nèi)信號通路SR-B I-PI3K-AKT抑制NF- k B的核轉(zhuǎn)位和炎癥因子的表達(dá)。故提出假設(shè)：可能是高密度脂蛋白結(jié)合的S1PR2對血管內(nèi)皮炎癥的影響和強(qiáng)度部分或主要依賴于SR-B I。
　　[方法]1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells HUVEC)，選擇不同濃度和不同時間的ox-LDL進(jìn)行處

3、理后，采用Western Blot檢測S1PR2的蛋白表達(dá)水平。2.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，選擇不同濃度的S1P進(jìn)行處理24h后，采用Western Blot檢測炎癥因子TNF- a、IL-10的蛋白表達(dá)水平，人Elisa試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF- a、IL-10和IL-10的含量。3.以ox-LDL60 ug/ml的濃度處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h后，分別用 S1P(1uM)，S1P(1uM)和VPC23019(S1PR1/3抑制

4、劑，10uM)，S1P(1uM)和JTE-013(S1PR2抑制劑，10uM)處理24h，采用Western Blot檢測炎癥因子TNF-a、IL-10的蛋白表達(dá)水平，人Elisa試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF- a、IL-10和IL-10的含量。4.以ox-LDL60 u g/ml的濃度處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h后，分別以S1P(1 uM)，apoA-1(30ug/ml)，apoA-1(30ug/ml)+BLT-1(10uM)以及o

5、x-LDL60 u g/ml的濃度處理轉(zhuǎn)染了SR-B I到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h后，用 apoA-1(30ug/ml)處理24h后，米用 Western Blot檢測SR-B I，炎癥因子TNF-a、IL-10的蛋白表達(dá)水平，人Elisa試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF- a、IL-10和IL-10的含量。5.以ox-LDL60 u g/ml的濃度處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h后，加入S1P(1uM)處理，再分別加入 apoA-1(30ug

6、/ml)，apoA-1(30ug/ml)+LY294002(10 uM)(PI3K抑制劑），apoA-1(30 ug/ml)+MK2206(1 uM)(Akt抑制劑），L-NAME(50umol/L)(eNOS抑制劑）處理24 h后，采用 Western Blot檢測PI3K，AKT的磷酸化水平；eNOS試劑盒檢測NOS的活性；免疫熒光檢測NF-kB的核轉(zhuǎn)位。
　　[結(jié)果]1.60 u g/ml ox-LDL處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6

7、h，S1PR2的蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高。2.1uM S1P處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h后，炎癥因子TNFa、IL-10的蛋白的表達(dá)水平及培養(yǎng)液中水平達(dá)到最高。3.與ox-LDL60 u g/ml處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞組相比較，S1P(1^M)組和S1P(L和VPC23019(S1PR1/3抑制劑，10uM)組炎癥因子TNF-a、I L-10的蛋白的表達(dá)水平及培養(yǎng)液中水平顯著提高。4.與ox-LDL60ug/ml處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

8、組相比較，S1P(1uM)組和apoA-1(30ug/ml)+BLT-1(10^M)組炎癥因子 TNF- a、IL-10的蛋白的表達(dá)水平及培養(yǎng)液中水平顯著提高。5. ox-LDL60 u g/ml的濃度處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h，與S1P(1uM)+ apoA-1(30ug/ml)組相比較，S1P(1uM)+ apoA-1(30ug/ml)+LY294002(10uM)(PI3K抑制劑），S1P(1uM)+ apoA-1(30ug/