自組裝siRNA-DNA納米管構建及其調節(jié)肺動脈平滑肌細胞自噬作用的研究.pdf

1、基因治療在疾病治療中具有巨大的應用潛力，研究可以傳遞各種目的基因的載體是納米醫(yī)學最重要的研究課題之一。目前，已經(jīng)報道了許多藥物傳遞載體，如高分子聚合物、陽離子脂質體、各種納米材料、病毒衣殼等。這些傳遞系統(tǒng)的有效性已被證實，然而其大部分為外源性物質，缺乏組織特異性且具有潛在毒性。隨著DNA分子自組裝納米技術的發(fā)展，自組裝DNA納米結構在生物學領域的應用變成現(xiàn)實。DNA分子的優(yōu)勢在于其穩(wěn)定性，易生物降解，與其它的藥物傳遞材料相比，DNA分子

2、對于人體具有天然性、無免疫原性、無毒等優(yōu)點。大量研究顯示，自組裝DNA納米結構可以用于細胞內(nèi)的貨物傳遞。并且，DNA納米結構可以依據(jù)需遞送的信號分子、緩釋需要或者靶向配體等因素進行結構的優(yōu)化。因此，自組裝DNA納米材料是理想的遞送平臺。
　　肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）嚴重威脅人類健康，患者5年生存率只有60％。低氧誘導肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary arterial

3、smooth muscle cells，PASMCs)異常增殖和凋亡抵抗導致的肺血管重構(Pulmonary vascular remodeling，PVR)是肺動脈高壓發(fā)生的重要病理生理基礎。自噬是一種廣泛存在于哺乳動物細胞中的保守的、維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機制。最近的研究證實，其在肺血管疾病，如肺動脈高壓、慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而，自噬在肺動脈高壓血管重構過程中，特別是在肺動脈平滑肌細胞生物學效應的影響尚不十分清

4、楚。故深入研究自噬在低氧誘導PASMCs增殖中的作用與機制，從而進一步闡明低氧致肺血管重構的分子機制，可望為防治PAH提供新的靶點及策略。
　　鑒于此，我們設計研發(fā)了一種以四條DNA單鏈自組裝的DNA納米管，并結合DNA-RNA雜交技術將功能基因mTOR siRNA以特定的比例組裝進入納米管結構。研究分析其有效性，并深入探討其對常氧或低氧條件下大鼠PASMCs自噬與增殖的影響。研究結論將進一步完善低氧致肺血管重構的分子機制，有望為

5、肺高壓等血管重構性疾病的防治提供新的理論依據(jù)和策略。
　　目的:
　　自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管，分析其有效性，并研究其對RPASMCs自噬和增殖的影響。
　　方法:
　　1.自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管(siRNA-NTs)及其特性研究
　　(1)采用序列對稱性原理，三臂星形模塊方案自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管;
　　(2)通過凝膠電泳，原子力顯微鏡

6、分析、表征DNA納米管的結構;
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管在RPASMCs的攝取及轉染效率觀察
　　體外培養(yǎng)來源于SD大鼠的肺動脈平滑肌細胞(RPASMCs)，由siRNA-NTs轉染RPASMCs;應用激光共聚焦顯微鏡觀察RPASMCs對不同濃度的siRNA-NTs的攝取以及同一濃度不同時間點的攝取情況;流式細胞術檢測siRNA-NTs在RPASMCs的轉染效率及細胞內(nèi)攝取平均熒光強度;通過激光共聚焦觀

7、察DNA納米管在RPASMCs的內(nèi)吞進程。
　　3.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管對常氧下RPASMCs自噬作用的研究
　　由siRNA-NTs轉染RPASMCs，激光共聚焦顯微鏡觀察siRNA-NTs對RPASMCs自噬的影響;透射電鏡對比觀察siRNA-NTs誘導RPASMCs自噬的細胞超微結構;RT-PCR檢測siRNA-NTs轉染RPASMCs后mTOR mRNA的表達;Western blot檢測siRNA

8、-NTs轉染RPASMCs后，p-mTOR、T-mTOR、LC3B和PACN的表達;MTT法檢測siRNA-NTs對RPASMCs生長抑制作用的濃度及時間依賴性。
　　4.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管對低氧下RPASMCs自噬作用的研究
　　由siRNA-NTs轉染RPASMCs，低氧處理。激光共聚焦顯微鏡觀察siRNA-NTs對低氧下RPASMCs自噬的影響;Western blot檢測siRNA-NTs轉染RP

9、ASMCs后，p-mTOR、LC3B和PACN的表達變化;MTT、3H-TdR檢測siRNA-NTs轉染RPASMCs后，對細胞活力及增殖的影響。
　　結果:
　　1.納米材料的構建和表征分析。(1)成功自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管(siRNA-NTs);(2)非變性PAGE膠分析、表征其產(chǎn)率高、結構穩(wěn)定;(3)原子力顯微鏡掃描顯示，DNA納米管粒子粒度分布均勻。
　　2.細胞攝取攜帶mTOR siRN

10、A的DNA納米管具有劑量及時間依賴的特點。(1)激光共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取siRNACy3-NTs具有劑量及時間依賴性，隨劑量及轉染孵育時間的增加，細胞內(nèi)紅色熒光顆粒逐漸增多，且當濃度為50 nM及孵育12-24 h達到較高的細胞內(nèi)攝取(P＜0.05)。并顯著強于單獨的siRNA對照組(P＜0.05)(2)流式細胞術檢測結果顯示細胞攝取siRNACy3-NTs具有劑量及時間依賴性，隨劑量及轉染孵育時間的增加，細胞轉染效率逐漸升高，且當

11、濃度為50 nM及轉染孵育12-24 h達到較高的轉染效率(P＜0.05）。同時，細胞內(nèi)攝取的平均熒光密度也具有劑量及時間依賴性，且顯著強于單獨的siRNA組（P＜0.05）。上述結果提示自組裝的siRNA-DNA納米管結構可以有效促進其攜帶的mTOR siRNA轉運進入RPASMCs內(nèi)，同時穩(wěn)定釋放。(3)激光共聚焦觀察siRNACy3-NTs納米粒子在細胞的內(nèi)吞進程，結果顯示Cy3紅色熒光標記的攜帶mTOR siRNA的DNA納米管

12、隨時間延長逐漸從胞膜進入胞質，并定位于內(nèi)涵體。
　　3.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管系統(tǒng)影響肺動脈平滑肌細胞自噬和增殖。(1)激光共聚焦圖像顯示紅色熒光標記的siRNACy3-NTs與綠色標記的細胞內(nèi)自噬小體位于同一區(qū)域。(2) mTOR siRNA誘導肺動脈平滑肌細胞自噬。激光共聚焦圖像顯示siRNA-NTs組細胞內(nèi)可見大量標記自噬小體的綠色熒光，且顯著強于對照組及單獨的siRNA組(P＜0.05），甚至明顯強于雷帕霉

13、素組（陽性對照組）(P＜0.05)。透射電鏡圖像顯示:siRNA-NTs組細胞內(nèi)可見大量自噬小體聚集，明顯多于對照組及單獨的納米管及siRNA組。Westernblot結果及半定量分析顯示siRNA-NTs組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達顯著強于單獨的siRNA組及單獨的納米管組(P＜0.05)。(3)攜帶mTOR siRNA的DNA納米管通過抑制mTOR信號增強LC3B蛋白表達。RT-PCR結果顯示mTOR mRNA表達抑制具有劑量及時間依賴

14、性。且當濃度為50 nM及轉染孵育48 h達到較高的抑制率(P＜0.05)。Westernblot結果顯示p-mTOR及T-mTOR蛋白表達抑制具有時間依賴性，孵育48h、72h的mTOR蛋白水平明顯低于24h(P＜0.05)。Westernblot結果顯示LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達隨mTOR蛋白表達抑制而升高，且于48h達到最高峰，相反，PCNA蛋白表達隨mTOR蛋白表達抑制而下降。提示通過下調mTOR表達，誘導細胞自噬，抑制增殖。(4)

15、 MTT檢測結果顯示:攜帶mTOR siRNA的DNA納米管以濃度及時間依賴的方式抑制細胞生長。
　　4.mTOR信號調節(jié)低氧誘導的細胞自噬和增殖。(1)攜帶mTOR siRNA的DNA納米管促進低氧誘導的細胞自噬。激光共聚焦圖像顯示siRNA-NTs組細胞內(nèi)可見大量標記自噬小體的綠色熒光，且顯著強于低氧對照組及單獨siRNA組。Westernblot結果顯示低氧組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達較常氧組升高(P＜0.05），siRNA-N

16、Ts組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達明顯強于其它各組(P＜0.05）。(2)攜帶mTOR siRNA的DNA納米管抑制低氧誘導的細胞增殖。MTT結果顯示:siRNA-NTs組細胞活力明顯下降，且顯著低于低氧下其它各組(P＜0.05)。[3H]TdR結果顯示:siRNA-NTs組細胞增殖較低氧對照組明顯下降，且明顯低于單獨的siRNA組(P＜0.05）。(3)mTOR調節(jié)低氧誘導的LC3B及PCNA蛋白表達。Westemblot結果顯示siRNA

17、-NTs組抑制p-mTOR及PCNA蛋白表達，同時升高LC3B蛋白表達水平。提示抑制mTOR表達，可以誘導細胞自噬，導致細胞自噬性死亡，進而抑制細胞增殖。
　　結論:
　　1.成功自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管，該納米管粒子結構穩(wěn)定，通過內(nèi)吞途徑進入細胞，其細胞轉染和攝取呈時間和劑量依賴性。
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管顯著抑制常氧和低氧下肺動脈平滑肌細胞中mTOR的表達，進而誘導細胞自