多巴胺D1類(lèi)受體對(duì)對(duì)氧磷酶2的調(diào)節(jié)在腎臟細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 多巴胺D1類(lèi)受體對(duì)對(duì)氧磷酶2的調(diào)節(jié)在腎臟細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用
　　目的：研究多巴胺D1R和D5R對(duì)PON2的調(diào)節(jié)在腎臟細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用。
　　方法：1.以小鼠腎臟切片以及D1R轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(HEK-hD1R)及D5R轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(HEK-hD5R)以及hRPT細(xì)胞為研究對(duì)象，采用免疫熒光的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察多巴胺D1R與PON2以及D5

2、R與PON2的各自表達(dá)情況以及是否存在共定位現(xiàn)象;多巴胺D1類(lèi)受體激動(dòng)劑fenoldopam短效刺激(1μM，15 min)后，D1R與PON2，D5R與PON2共定位現(xiàn)象是否發(fā)生改變。
　　2.以HEK-hD1R、HEK-hD5R及hRPT細(xì)胞為研究對(duì)象，采用蔗糖密度梯度離心法提取細(xì)胞膜LRs及non-LRs組分，用免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)，觀察fenoldopam(1μM，15 min)或膽固醇消耗劑甲基-β-環(huán)糊精(methy

3、l-β-cyclodextrin，βCD)(2％，60 min)對(duì) PON2在細(xì)胞膜LRs及non-LRs分布的影響。
　　3.在HEK-hD1R、HEK-hD5R細(xì)胞上，用免疫印跡法觀察fenoldopam刺激不同時(shí)間（1μM，2-24 h）對(duì)PON2蛋白表達(dá)的影響，以及用D1類(lèi)受體阻斷劑SCH23390(1μM，24 h)對(duì)PON2變化的影響。定量PCR方法觀察fenoldopam長(zhǎng)效刺激（1μM，24 h）對(duì)PON2基因轉(zhuǎn)錄

4、的影響。
　　4.用免疫印跡法觀察D5R基因敲除小鼠腎臟皮質(zhì)PON2表達(dá)變化;在hRPT細(xì)胞上，用D5R-siRNA沉默D5R基因，免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，觀察對(duì)PON2、NOX2表達(dá)以及ROS生成的影響。
　　5.用PON2-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉默PON2基因，用H2DCFDA熒光法測(cè)ROS生成及光澤精發(fā)光法檢測(cè)NADPH氧化酶活性，分別觀察PON2在fenoldopam長(zhǎng)效刺激(1μM，24 h)調(diào)節(jié)ROS生成及NADP

5、H氧化酶活性中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.為了解D1類(lèi)受體與PON2的作用是否通過(guò)直接的物理連接實(shí)現(xiàn)，我們首先進(jìn)行了共定位檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D1R、D5R與PON2在小鼠腎臟近端小管刷狀緣上表達(dá)豐富，D1R與PON2以及D5R與PON2在小鼠腎臟近端小管刷狀緣存在共定位;在hRPT以及HEK-hD1R、HEK-hD5R細(xì)胞上，基礎(chǔ)狀態(tài)下D1R和D5R主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，PON2主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，D1R與PON2以及D

6、5R與PON2有部分共定位，fenoldopam短效刺激促進(jìn)D1R和D5R的內(nèi)化，與PON2在細(xì)胞漿內(nèi)的共定位增加。
　　2.我們推測(cè)D1類(lèi)受體對(duì)PON2的調(diào)節(jié)可能有細(xì)胞膜LRs參與。通過(guò)蔗糖密度梯度離心法，觀察到在HEK-hD1R細(xì)胞上，fenoldopam短效刺激導(dǎo)致LRs及non-LRs內(nèi)PON2蛋白含量均升高;在HEK-hD5R及hRPT細(xì)胞上，fenoldopam刺激僅升高non-LRs內(nèi)PON2蛋白含量而對(duì)LRs內(nèi)PO

7、N2含量無(wú)明顯影響。在這三種細(xì)胞上，βCD均能促進(jìn)PON2從LRs向non-LRs組分內(nèi)轉(zhuǎn)移。這體現(xiàn)了D1R與D5R調(diào)節(jié)PON2的不同作用，可能與D1R與D5R不同的抗氧化機(jī)制相關(guān)。
　　3.為檢測(cè)PON2在D1受體長(zhǎng)效抗氧化應(yīng)激中的作用，首先觀察長(zhǎng)效激動(dòng)D1類(lèi)受體對(duì)PON2表達(dá)的影響。在HEK-hD5R細(xì)胞上，fenoldopam刺激可呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性地增加PON2蛋白表達(dá)，并且該效應(yīng)可被D1類(lèi)受體阻斷劑逆轉(zhuǎn)，而在HEK-hD1R

8、細(xì)胞上，fenoldopam刺激對(duì)PON2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。Fenoldopam長(zhǎng)效刺激還可升高HEK-hD5R細(xì)胞PON2mRNA表達(dá)而對(duì)HEK-hD1R細(xì)胞無(wú)影響。這也證明了D1R與D5R對(duì)PON2的差異性調(diào)節(jié)。
　　4.D5R基因敲除小鼠PON2表達(dá)下降;在hRPT細(xì)胞上，D5R-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞PON2表達(dá)下降、NOX2表達(dá)上調(diào);D5R-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞ROS生成增加，該作用可被apocynin逆轉(zhuǎn)。
　　5.

9、在hRPT細(xì)胞上，PON2-siRNA明顯削弱了fenoldopam長(zhǎng)效刺激對(duì)NADPH氧化酶活性及ROS生成的抑制作用。
　　結(jié)論：D1R和D5R通過(guò)對(duì)PON2的不同調(diào)控機(jī)制，以及在短效、長(zhǎng)效作用中的不同作用發(fā)揮對(duì)氧化應(yīng)激的差異性調(diào)節(jié)。其中，在短效作用中，D1R可通過(guò)上調(diào)LRs內(nèi)PON2表達(dá)參與抗氧化調(diào)節(jié)，而D5R則促使PON2向non-LRs轉(zhuǎn)位，可能通過(guò)其他的作用機(jī)制參與抑制氧化應(yīng)激。在長(zhǎng)效作用中，D1R對(duì)PON2表達(dá)無(wú)影響

10、，而D5R通過(guò)上調(diào)PON2表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用。本研究闡釋了D1類(lèi)受體在抗氧化作用中的新機(jī)制，以及受體亞型的差異性作用，為藥物治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　第二部分 多巴胺D3受體與血管緊張素Ⅱ2型受體的交互作用對(duì)腎臟水鈉排泄的影響
　　目的：研究多巴胺D3R與AT2R的交互作用對(duì)腎臟水鈉排泄的影響及機(jī)制研究。
　　方法：1.采用腎動(dòng)脈灌注技術(shù)，觀察D3R受體激動(dòng)劑PD128907和AT2R受體激動(dòng)劑CGP42112A單獨(dú)灌

11、注及共同灌注對(duì)Wistar大鼠腎臟水鈉排泄的影響，并在D3R受體阻斷劑U99194A或AT2R受體阻斷劑PD123319聯(lián)合灌注時(shí)，觀察PD128907及CGP42112A單獨(dú)及共同灌注利尿排鈉作用的變化。
　　2.用哇巴因法檢測(cè)PD128907和CGP42112A單獨(dú)刺激或共同刺激WKY RPT細(xì)胞對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的影響，并在U99194A或PD123319聯(lián)合刺激時(shí)，檢測(cè)PD128907及CGP42112A分別及聯(lián)

12、合刺激對(duì)Na+-K+-ATP酶活性影響的變化。
　　3.采用免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察Wiser大鼠腎臟以及WKYRPT細(xì)胞上D3R與AT2R的各自表達(dá)情況，以及是否存在共定位，PD128907、CGP42112A單獨(dú)或共同刺激后，共定位是否發(fā)生改變。
　　4.探索WKY RPT細(xì)胞上D3R與AT2R相互作用的機(jī)制。
　　結(jié)果：1.為觀察激活腎臟D3R與AT2R是否在大鼠體內(nèi)交互作用而產(chǎn)生利尿排鈉效應(yīng)，我們

13、首先通過(guò)腎灌注PD128907及CGP42112A，觀察尿量及尿鈉排泄變化。結(jié)果顯示在Wistar大鼠上分別灌注PD128907與CGP42112A可產(chǎn)生促進(jìn)水鈉排泄的作用，并且分別被D3R或AT2R阻斷劑所阻斷。兩藥共同灌注可產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)的排鈉利尿作用，該作用可被D3R或AT2R受體阻斷劑逆轉(zhuǎn)。證明了共刺激D3R或AT2R可引起協(xié)同放大的促水鈉排泄作用，并且與D3R或AT2R特異性相關(guān)。
　　2.為檢測(cè)D3R與AT2R在離體細(xì)胞

14、實(shí)驗(yàn)中是否也存在交互作用而促進(jìn)鈉排泄，我們通過(guò)哇巴因法測(cè)定PD128907與CGP42112A對(duì)WKY RPT細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性的影響。結(jié)果顯示PD128907與CGP42112A分別刺激WKY RPT細(xì)胞均可抑制Na+-K+-ATP酶活性，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，該效應(yīng)可分別被D3R或AT2R阻斷劑逆轉(zhuǎn)。PD128907與CGP42112A共同刺激時(shí)產(chǎn)生協(xié)同增強(qiáng)的抑制效應(yīng)，D3R或AT2R阻斷劑可阻斷該效應(yīng)。證明共刺激D3R或A

15、T2R可以協(xié)同抑制Na+-K+-ATP酶活性，并且與D3R或AT2R受體特異性相關(guān)。
　　3.因?yàn)镈3R與AT2R信號(hào)傳導(dǎo)均與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases，MAPK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)相關(guān)，因此我們?cè)跈C(jī)制研究中，觀察了PD128907與CGP42112A共作用對(duì)磷酸化ERK的影響。結(jié)果顯示

16、共刺激D3R和AT2R時(shí)，磷酸化ERK表達(dá)協(xié)同增強(qiáng)，MAPK-ERK信號(hào)通路可能參與了D3R和AT2R的協(xié)同效應(yīng)。再用MAPK抑制劑PD98059聯(lián)合用藥，觀察對(duì)D3R和AT2R協(xié)同效應(yīng)有無(wú)阻斷作用。結(jié)果顯示PD98059可逆轉(zhuǎn)PD128907與CGP42112A共刺激對(duì)D3R和AT2R共定位及共連接的增強(qiáng)作用，并阻斷了對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的協(xié)同抑制效應(yīng)。證明MAPK-ERK信號(hào)通路參與了D3R和AT2R協(xié)同效應(yīng)。
　　結(jié)

17、論：我們的研究表明，D3R與AT2R存在交互作用，共刺激時(shí)通過(guò)促進(jìn)D3R或AT2R的正向交互作用、對(duì)Na+-K+-ATP酶活性的協(xié)同抑制，產(chǎn)生協(xié)同放大的利尿排鈉效應(yīng)，該效應(yīng)與MAPK-ERK信號(hào)通路相關(guān)。本研究證明了多巴胺受體與血管緊張素Ⅱ受體的交互作用也可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，這種同向的調(diào)節(jié)活動(dòng)與受體間交互作用的增強(qiáng)以及協(xié)同激活共同信號(hào)通路相關(guān)。說(shuō)明外周多巴胺系統(tǒng)與RAS之間除了相互拮抗發(fā)揮調(diào)節(jié)作用外，還可通過(guò)互相促進(jìn)、協(xié)同增強(qiáng)的方式同向參與