多巴胺D1類受體參與Th17細(xì)胞分化及急性哮喘發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞以及它們分泌的各種炎性因子參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應(yīng)、粘液高分泌及可逆性氣流受限，晚期還可出現(xiàn)氣道重塑。Th2占優(yōu)勢的Th1/Th2失衡被傳統(tǒng)觀念認(rèn)為是哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制。Th2細(xì)胞導(dǎo)致嗜酸細(xì)胞性哮喘(Eosinophilic asthma，EA)的發(fā)病。臨床上運(yùn)用一線藥物糖皮質(zhì)激素和（或）β受體激動劑能夠控制絕大多數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞哮喘患者的癥狀和提高他們的生活質(zhì)量。但部分患者卻表現(xiàn)出糖皮質(zhì)激素抵

2、抗，這類患者多為中性粒細(xì)胞性哮喘，且病情嚴(yán)重，已成為臨床研究的難點。因此這類患者的生理病理特點，疾病的發(fā)病機(jī)制，新的有效的治療靶點和方法成為近年來哮喘領(lǐng)域的研究熱點。
　　近年來新發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞，能很好地解釋“Th2理論”不能解釋的一些實驗和臨床現(xiàn)象。Th17細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素(interleukin-17，IL-17)。IL-17介導(dǎo)的信號途徑可誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子刺激組織，能招募中性粒細(xì)胞在氣道局部聚集并激活，導(dǎo)

3、致組織浸潤和組織損害。糖皮質(zhì)激素不僅不能抑制中性粒細(xì)胞，反而能增加中性粒細(xì)胞的活性和生存周期。此外，IL-17還參與氣道重塑。已有文獻(xiàn)證實Th17/IL-17軸與哮喘的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。綜上所述，進(jìn)一步從分子水平探討Th17/IL-17軸，尤其是該軸的上游，有望進(jìn)一步了解哮喘的發(fā)病機(jī)制，為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。
　　多巴胺受體可分為D1類和D2類受體，多巴胺D1類受體與神經(jīng)和精神疾患的關(guān)系已有大量的研究，多巴胺D1類受體是

4、治療這些精神疾患的一個重要靶點。最近有研究發(fā)現(xiàn)多巴胺D1類受體還參與免疫疾病的發(fā)病機(jī)制。D1類受體拮抗劑可以抑制Th17和Th2細(xì)胞的分化，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，預(yù)防及治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）、治療非肥胖的糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠、能減少小鼠腎毒性血清腎炎（nephrotoxic serum nep

5、hritis, NTN）新月體的形成，能減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的炎癥反應(yīng)，減少關(guān)節(jié)的損傷。因為Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的過度活化及Th1細(xì)胞的抑制，參與哮喘的發(fā)病，所以，我們推測D1類受體可能通過影響Th17細(xì)胞而參與哮喘的發(fā)病。
　　首先我們通過分別用D1受體拮抗劑、激動劑和生理鹽水干預(yù)小鼠哮喘模型，觀察各組小鼠的一般行為活動，檢測肺功能，對支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)進(jìn)

6、行細(xì)胞分類計數(shù)及檢測其IL-17的水平，觀察肺病理切片、用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）檢測脾臟CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測脾CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-17的水平。通過這些指標(biāo)來觀察D1受體拮抗劑和激動劑對哮喘小鼠的影響及在體內(nèi)對Th17/IL-17軸的影響。
　　我們進(jìn)一步探討DI類受體影響Th

7、17細(xì)胞可能的信號通路。Nakagome K等認(rèn)為可能是D1類受體激動后增加初始CD4+T細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。此外，D1類受體影響DC分泌IL-23可能亦是其影響Th17細(xì)胞途徑之一。但環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)為什么能促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化？目前無相關(guān)報道。本實驗將探討cAMP促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的信號通路。

8、　　D1類受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR)，它介導(dǎo)經(jīng)典信號通路Gs/AC/cAMP通路。Zhen等發(fā)現(xiàn)激動D1受體可增加胞內(nèi)cAMP的濃度，進(jìn)而激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)。p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的交匯點和共同通路，可激活核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclearfactor-kappa b，N

9、F-kB)。NF-kB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可控制BATF基因的轉(zhuǎn)錄。
　　BATF(B cell activating transcription factor)是近期發(fā)現(xiàn)的AP-1(activator protein1)家族新成員。BATF是Th17細(xì)胞不可缺少的一個核轉(zhuǎn)錄因子，它參與RORα和RORγt表達(dá)的維持，并且通過直接結(jié)合在IL-17基因的啟動子上，和RORγt協(xié)同誘導(dǎo)IL-17的表達(dá)。基于上述，我們大膽推測

10、，D1類受體可通過調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。
　　本研究將在體外探討D1類受體是否通過調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。首先分離、純化正常小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞并予Th17細(xì)胞定向分化的環(huán)境，同時分別用D1類受體拮抗劑和激動劑干預(yù)。定向分化3天后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，免疫蛋白印跡(western blot，WB)檢測RORγt和BATF的表達(dá)。探討了D1類受

11、體對Th17細(xì)胞分化及對BATF表達(dá)的影響后，用BATF小干擾RNA(short interferingRNA，siRNA)和對照siRNA(即無干擾效果的siRNA)轉(zhuǎn)染兩組小鼠脾CD4+T細(xì)胞，再予Th17細(xì)胞定向分化的壞境，同時加入D1類受體激動劑。培養(yǎng)分化細(xì)胞后，用WB檢測BATF的表達(dá)，評估用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，BATF的沉默效果。在檢測到BATF的沉默效果佳后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例，WB檢測RORγt的表達(dá)，

12、ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，觀察D1類受體激活后，BATF基因部分沉默和正常表達(dá)時Th17細(xì)胞的分化情況，以期闡明D1類受體影響Th17細(xì)胞分化的信號通路。
　　第一章多巴胺D1類受體對急性哮喘氣道炎癥及Th17/IL-17軸的影響
　　目的：
　　(1)建立急性哮喘小鼠模型，并鑒定建立的模型是否成功;
　　(2)觀察D1類受體拮抗劑和激動劑對急性哮喘小鼠氣道炎癥及Th17/IL-17軸的影響。<

13、br>　　方法：
　　將24只SPF級BABL/c雌性小鼠隨機(jī)分為四組:正常對照組(CK)、哮喘組(AS)、D1類受體拮抗劑SCH23390干預(yù)哮喘組(SCH干預(yù)組)和D1類受體激動劑SKF83959干預(yù)哮喘組（SKF干預(yù)組）各6只。用OVA致敏、激發(fā)建立急性哮喘模型，正常對照組以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā)，SCH干預(yù)組和SKF干預(yù)組每次霧化前30min均予腹腔注射相應(yīng)的試劑，末次激發(fā)24 h后處理所有小鼠:(1)對小鼠的

14、一般行為活動進(jìn)行觀察;(2)收集BALF行細(xì)胞計數(shù)、分類，檢測BALF中IL-17的濃度;(3)肺組織病理切片觀察炎癥細(xì)胞浸潤及黏液分泌;(4)研磨各組小鼠脾臟，制備單個核細(xì)胞懸液，MACS技術(shù)分離脾臟CD4+T細(xì)胞，計算脾源性CD4+T細(xì)胞總數(shù)，判斷細(xì)胞活力;(5)測定脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度;(6)乙酰甲膽堿激發(fā)小鼠后，有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應(yīng)性。
　　結(jié)果：
　　(

15、1)正常組小鼠表現(xiàn)正常，哮喘組小鼠出現(xiàn)典型的哮喘樣癥狀， SCH干預(yù)組小鼠癥狀明顯減輕;而SKF干預(yù)組小鼠癥狀有所加重;
　　(2)與正常組相比，哮喘組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、Lym、Neu、Eos數(shù)量及IL-17的濃度均顯著增加（均P＜0.05）;SCH干預(yù)組白細(xì)胞總數(shù)、Eos、Lym、 Neu數(shù)量及IL-17的濃度均較哮喘組有所降低(P＜0.05);而SKF干預(yù)組白細(xì)胞總數(shù)、Eos、Lym、Neu數(shù)量及IL-17的濃度均較哮喘組

16、有所增加（P＜0.05）;
　　(3)與正常組相比，哮喘組小鼠肺部大量炎癥細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞增生、氣道分泌大量黏液(P＜0.05);SCH干預(yù)組氣道炎癥和黏液高分泌狀態(tài)較哮喘組有所緩解(P＜0.05);而SKF干預(yù)組氣道炎癥和黏液高分泌狀態(tài)較哮喘組加重(P＜0.05);
　　(4)與正常組相比，哮喘組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.01);與哮喘組相比，SCH干預(yù)組脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P＜0.01

17、）;與哮喘組相比，SKF干預(yù)組脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量均明顯增加(P＜0.01);
　　(5)與正常組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度顯著增加(P＜0.01);SCH干預(yù)組Th17細(xì)胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度較哮喘組有所降低（P＜0.01）;而SKF干預(yù)組Th17細(xì)胞比例及其培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度較哮喘組有所降低(P＜0.01);
　　(6)與正常組相比，

18、哮喘組氣道反應(yīng)性顯著增高(P＜0.05);與哮喘組相比，SCH干預(yù)組小鼠氣道反應(yīng)性有所降低（P＜0.05），而SKF干預(yù)組氣道反應(yīng)性有所升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　(1)本實驗中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的，Th17/IL-17軸參與了哮喘的發(fā)病;
　　(2)D1類受體參與了哮喘的發(fā)病，對Th17/IL-17軸的調(diào)節(jié)是其中的一個機(jī)制。
　　第二章多巴胺D1類受體調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化

19、r>　　目的：
　　(1)探討在體外D1類受體對Th17細(xì)胞分化的影響及D1類受體對BATF表達(dá)的影響;
　　(2)證實D1類受體通過調(diào)控BATF促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。
　　方法：
　　體外實驗分兩部分:第一部分將MACS分離純化獲得的正常小鼠脾CD4+T細(xì)胞分成三組:原液對照組、D1類受體拮抗劑SCH23390干預(yù)組和D1類受體激動劑SKF83959干預(yù)組。每組予Th17細(xì)胞定向分化的環(huán)境，并予相應(yīng)的試劑干預(yù)

20、。培養(yǎng)分化細(xì)胞后，分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，WB檢測RORγt和BATF的表達(dá)。
　　第二部分將正常小鼠脾CD4+T細(xì)胞分成兩組:BATF-siRNA組和對照siRNA組。首先我們分別用可以沉默BATF表達(dá)的BATF siRNA和對照siRNA(即無干擾效果的siRNA)轉(zhuǎn)染兩組小鼠脾CD4+T細(xì)胞，再予Th17細(xì)胞定向分化的環(huán)境，同時加入D1類受體激動劑SKF83959。

21、培養(yǎng)分化細(xì)胞后，用WB檢測BATF的表達(dá)，評估用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，BATF的沉默效果。在檢測到BATF的沉默效果佳后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞的比例，WB檢測RORγt的表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度，觀察D1類受體激活后，BATF基因部分沉默和正常表達(dá)時Th17細(xì)胞的分化情況。
　　結(jié)果：
　　(1)與原液對照組相比，SCH23390干預(yù)組Th17細(xì)胞所占的比例明顯下降（P＜0.01），而SKF8

22、3959干預(yù)組Th17細(xì)胞所占的比例有所升高（P＜0.01）;
　　(2)與原液對照組相比，SCH23390干預(yù)組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度明顯下降(P＜0.01)，而SKF83959干預(yù)組培養(yǎng)液上清中IL-17的濃度明顯升高(P＜0.01);
　　(3)與原液對照組相比，SCH23390干預(yù)組RORγt的表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，而SKF83959干預(yù)組RORγt的表達(dá)明顯升高(P＜0.0t);
　　(4)與原

23、液對照組相比，SCH23390干預(yù)組BATF的表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，而SKF83959干預(yù)組BATF的表達(dá)明顯升高(P＜0.01);
　　(5)BATF-siRNA組BATF的表達(dá)比對照siRNA組明顯下降(P＜0.01);
　　(6)BATF-siRNA組Th17細(xì)胞所占的比例比對照siRNA組明顯下降(P＜0.01);
　　(7)BATF-siRNA組RORγt的表達(dá)比對照siRNA組明顯下降（P＜0.01