急性哮喘小鼠中T-bet通過IL-23受體對Th17細胞增殖和致炎機能的影響.pdf

1、第一部分、急性哮喘小鼠模型的建立與評價
　　 目的：通過補充完善急性哮喘動物模型評價標準，探討建立的急性哮喘小鼠模型是否成功。
　　 方法：35只SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分為兩組：哮喘組(20只)以O(shè)VA致敏、激發(fā)；正常對照組(15只)以等體積的PBS代替OVA致敏、激發(fā)，末次激發(fā)24 h后處理小鼠。查看小鼠的一般行為活動；霧化吸入Ach行支氣管激發(fā)試驗，有創(chuàng)肺阻抗法測定小鼠的氣道反應(yīng)性；BALF行細胞學分類、計

2、數(shù)；HE染色觀察肺組織的病理變化。研磨小鼠脾臟制成單個核細胞懸液，裂解紅細胞，免疫磁珠分離小鼠脾源性CD4+T細胞，懸于加有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時后，計算脾源性CD4+T細胞總數(shù)；流式儀檢測Th17細胞的陽性率；ELISA測定BALF和脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-17的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 (1)哮喘組小鼠出現(xiàn)類似于人的哮喘發(fā)作癥狀，而正常對照組小鼠表現(xiàn)

3、正常。
　　 (2)與正常對照組相比，哮喘組小鼠對Ach的刺激反應(yīng)明顯，濃度反應(yīng)曲線上移(均P<0.01)。
　　 (3)與正常對照組相比，哮喘組小鼠肺組織支氣管及血管周圍大量炎性細胞(包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)浸潤(P<0.01)。
　　 (4)與正常對照組相比，哮喘組小鼠BALF中白細胞總數(shù)、Neu(％)、Eos(％)和Lym(％)顯著增多(均P<0.01)。
　　 (5)與正

4、常對照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞總數(shù)和Th17細胞陽性率顯著增高(均P<0.01)。
　　 (6)與正常對照組相比，哮喘組小鼠BALF和脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-17的濃度顯著增高(均P<0.01)。
　　 (7)急性哮喘小鼠BALF中IL-17的濃度與Neu(％)顯著正相關(guān)(r=0.903，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.對脾源性CD4+T細胞總數(shù)、Th17細胞

5、陽性率和細胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度的檢測，可做為急性哮喘動物模型的評價標準。
　　 2.本實驗中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的。
　　 第二部分、IL-23受體對急性哮喘小鼠脾源性Th17細胞增殖和致炎機能的影響
　　 目的：通過檢測IL-23受體的表達、Th17細胞陽性率和IL-17的濃度，探討IL-23受體對急性哮喘小鼠脾源性Th17細胞增殖和致炎機能的影響。
　　 方法：Th17細胞的陽性率反應(yīng)其

6、增殖情況，細胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度反應(yīng)Th17細胞的致炎機能。免疫磁珠分離的小鼠脾源性CD4+T細胞懸于加有胎牛血清的RPMI-1640培基、ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時，real-time PCR和WB測定小鼠脾源性CD4+T細胞亞群Th17細胞中IL-23受體的表達，流式儀測定Th17細胞的陽性率，ELISA測定脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度，并分析哮喘組小鼠IL-23受體的表達和Th17細胞陽性率、IL-

7、17濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與正常對照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-23受體mRNA的表達顯著增高(P<0.01)。
　　 (2)與正常對照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-23受體蛋白的表達顯著增高(P<0.01)。
　　 (3)與正常對照組相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞中Th17細胞的陽性率顯著增高(P<0.01)。
　　 (4)與正常對照組

8、相比，哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度顯著增高于(P<0.01)。
　　 (5)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-23受體mRNA的表達與Th17細胞的陽性率顯著正相關(guān)(r=0.789，P<0.05)；與IL-17的濃度顯著正相關(guān)(r=0.788，P<0.05)。
　　 (6)哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-23受體蛋白的表達與Th17細胞的陽性率顯著正相關(guān)(r=0.828，P<0.01

9、)；與IL-17的濃度顯著正相關(guān)(r=0.802，P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性哮喘小鼠脾源性CD4+T細胞中IL-23受體的表達、Th17細胞的陽性率和IL-17的濃度均顯著增高。
　　 2.急性哮喘小鼠中IL-23受體的表達可能影響Th17細胞的增值和致炎機能。
　　 第三部分、下調(diào)T-bet表達通過影響IL-23受體促進Th17細胞的增殖和致炎機能
　　 目的：通過抑制T-b

10、et的表達，觀察對急性哮喘小鼠脾源性Th17細胞增殖和致炎機能的影響。
　　 方法：T-bet為觀察對象，IL-23受體為聯(lián)系T-bet和Th17細胞的橋梁，Th17細胞的陽性率反應(yīng)其增殖情況，細胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度反應(yīng)Th17細胞的致炎機能。三對siRNA-T-bet片斷和陰性對照，分別瞬時轉(zhuǎn)染哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞后，Western Blot和real-timePCR檢測T-bet的表達，篩選出具有最佳沉默效

11、果的片斷，此片斷轉(zhuǎn)染哮喘組小鼠脾源性CD4+T細胞。3組細胞：正常對照組、未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染最佳沉默siRNA片斷哮喘組的脾源性CD4+T細胞，懸于加有胎牛血清的RPMI-1640培基、ConA和PMA刺激培養(yǎng)24小時，檢測各組細胞中T-bet的表達、IL-23受體的表達、Th17陽性率和細胞培養(yǎng)上清中IL-17濃度，并分析轉(zhuǎn)染最佳沉默siRNA片斷哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-bet的表達與IL-23受體的表達、Th17陽性率、I

12、L-17濃度的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)三對siRNA片斷中以siRNA-T-bet-429沉默效果最為顯著(P<0.01)。
　　 (2)與正常對照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-bet mRNA的表達顯著降低(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-bet mRNA的表達顯著降

13、低(P<0.01)。
　　 (3)與正常對照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-bet蛋白的表達顯著降低(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-bet蛋白的表達顯著降低(P<0.01)。
　　 (4)與正常對照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中IL-

14、23受體mRNA的表達顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中IL-23受體mRNA的表達顯著增高(P<0.01)。
　　 (5)與正常對照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中IL-23受體蛋白的表達顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞

15、中IL-23受體蛋白的表達顯著增高(P<0.01)。
　　 (6)與正常對照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中Th17的陽性率顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中Th17的陽性率顯著增高(P<0.01)。
　　 (7)與正常對照組相比，未轉(zhuǎn)染哮喘組和轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源

16、性CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度顯著增高(均P<0.01)；與未轉(zhuǎn)染哮喘組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IL-17的濃度顯著增高(P<0.01)。
　　 (8)轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-betmRNA的表達與IL-23受體mRNA的表達顯著負相關(guān)(r=-0.786，P<0.05)，與Th17陽性率顯著負相關(guān)(r=-0.882，P<

17、0.01)，與IL-17的濃度顯著負相關(guān)(r=-0.893，P<0.01)。
　　 (9)轉(zhuǎn)染siRNA-T-bet-429哮喘組的脾源性CD4+T細胞中T-bet蛋白的表達與IL-23受體蛋白的表達顯著負相關(guān)(r=-0.873，P<0.01)，與Th17陽性率顯著負相關(guān)(r=-0.786，P<0.05)，與IL-17的濃度顯著負相關(guān)(r=-0.939，P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.急性哮喘中下調(diào)T-