Miro1在難治性癲癇病人和動物模型中表達(dá)變化的研究.pdf

1、癲癇是一種經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的疾病。通常情況下，癲癇是指大腦中的神經(jīng)元突然同步化異常放電，導(dǎo)致如凝視，痙攣等臨床表現(xiàn)與癥狀反復(fù)發(fā)作的慢性疾病。大約全球人口中5％的人在一生中至少經(jīng)歷過一次發(fā)作，并且全球約20%的人會在一生中經(jīng)歷反復(fù)發(fā)作。大部分的癲癇發(fā)作會被單一的抗癲癇藥物控制，而每個(gè)月發(fā)作一次上，用藥正確的情況下用藥超過三種，超過兩年治療仍然無效的是難治性癲癇[1]。大約有30%的癲癇病人屬于難治性癲癇（也稱為頑固性癲癇）[2]。近幾十年來

2、，諸多學(xué)者通過各種途徑實(shí)驗(yàn)方法來探究癲癇發(fā)作的分子機(jī)制。人們盡管在癲癇發(fā)病的過程機(jī)制方面取得巨大的進(jìn)展，但是仍然不能確定一種或者一類標(biāo)志物作為診斷癲癇發(fā)病的標(biāo)準(zhǔn)。目前，各類癲癇的致病機(jī)制人們?nèi)匀皇遣磺宄?，特別是非原發(fā)性癲癇，而是比如頭部外傷造成的癲癇，腫瘤壓迫刺激導(dǎo)致的癲癇，炎癥或長時(shí)間熱性驚厥誘發(fā)的癲癇[3]。由于以上幾點(diǎn)，癲癇的病理機(jī)制是多種因素與途徑導(dǎo)致的，所以沒有一個(gè)單一的癲癇發(fā)病黃金病理機(jī)制。在過去的幾十年中間，人們治療癲癇

3、是阻止癲癇發(fā)生的急性過程[4]，而現(xiàn)在醫(yī)生們在治療癲癇的觀念上一方面是阻止降低原發(fā)性自發(fā)發(fā)作，另一方面是治療患者的癲癇相關(guān)并發(fā)癥，比如認(rèn)知損傷和心理健康的損害[5,6]。全世界的研究者到目前為止在各種動物癲癇模型中發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的癲癇發(fā)病的分子水平和細(xì)胞水平的改變有：細(xì)胞死亡和神經(jīng)元損傷，軸突與樹突的可塑性，
　　神經(jīng)的發(fā)生，膠質(zhì)細(xì)胞的活化，血管損傷和生成，細(xì)胞外基質(zhì)的破裂，離子通道的結(jié)構(gòu)和功能的改變，突出前與突出后的修飾[7]。隨著

4、研究的進(jìn)展，近年來研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)生和能量代謝失衡關(guān)系十分密切，能量代謝物質(zhì)的不平衡會導(dǎo)致或誘發(fā)癲癇的發(fā)生。
　　與此同時(shí)，更多的新研究發(fā)現(xiàn)癲癇與腦內(nèi)能量供給的重要細(xì)胞器線粒體關(guān)系十分密切。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道大腦線粒體代謝功能異常對癲癇發(fā)病起著重要的作用[8]。近年來，線粒體運(yùn)動這一概念出現(xiàn)在人們的視野中，線粒體可以通過蛋白鏈接至微管[9]。在神經(jīng)元中，由馬達(dá)蛋白帶領(lǐng)的線粒體可從胞體運(yùn)輸至需要大量能量供應(yīng)的突觸附近。在線粒體的運(yùn)輸中，Mi

5、ro1是一個(gè)至關(guān)重要的蛋白，它一端鏈接線粒體外膜，另一端鏈接蛋白復(fù)合體與微管相連[10]?；诖耍瑸榱颂綄iro1以及線粒體運(yùn)輸是否與癲癇具有緊密聯(lián)系，我們做以下研究：
　　第一部分 Miro1在癲癇患者樣本中的表達(dá)分析
　　目的：研究Miro1在臨床樣本的表達(dá)情況。方法：從某大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科標(biāo)本庫隨機(jī)選取20例顳葉癲癇組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，10例外傷組織作為對照組。利用Western blot檢測Miro1在臨床癲癇樣

6、本顳葉皮質(zhì)以及海馬中的蛋白表達(dá)情況，同時(shí)用q-PCR檢測其mRNA表達(dá)情況，以及使用免疫組織化學(xué)染色鑒定顳葉皮質(zhì)中Miro1的表達(dá)以驗(yàn)證Western blot結(jié)果。結(jié)果：Miro1蛋白表達(dá)在癲癇組顳葉皮質(zhì)及海馬中與對照組相比顯著降低，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也印證了此降低趨勢，mRNA表達(dá)無明顯差異。結(jié)論：臨床樣本中Miro1在顳葉皮質(zhì)以及海馬中表達(dá)均顯著降低，這提示顳葉癲癇患者病灶區(qū)低代謝可能與Miro1的減少有關(guān)，Miro1在癲癇發(fā)生

7、過程中發(fā)揮重要作用。mRNA表達(dá)無差異而蛋白表達(dá)減少，提示可能癲癇發(fā)作時(shí)Miro1蛋白通過線粒體自噬代謝降解增多。
　　第二部分 Miro1在癲癇動物模型中的表達(dá)分析
　　目的：由于人類癲癇樣本在研究癲癇發(fā)病過程方面的限制性，我們研究Miro1在癲癇動物模型中全過程的表達(dá)情況。方法：建立SD大鼠氯化鋰-匹羅卡品模型并以注射生理鹽水組為對照，在模型建立成功后在不同時(shí)間點(diǎn)(SE1d、SE3d、SE5d、SE7d、SE14d、SE

8、30d、SE60d組)收集大鼠顳葉及海馬組織,每組8只。利用Western blot，q-PCR以及免疫組織化學(xué)檢測Miro1在癲癇大鼠皮層及海馬組織中的表達(dá)。結(jié)果：Miro1蛋白表達(dá)在癲癇動物模型顳葉皮質(zhì)急性期升高（SE1d，SE3d），恢復(fù)期前期升高（SE5d，SE7d），恢復(fù)期后期降低（SE14d），慢性期顯著降低（SE30d，SE60d)。Miro1在海馬中蛋白表達(dá)急性期升高（SE1d、SE3d），恢復(fù)期和慢性期降低（SE5d、

9、SE7d、SE14d、SE30d、SE60d）。同時(shí)我們對表達(dá)增高明顯的SE3d和降低顯著的SE60d進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果表明與蛋白表達(dá)趨勢一致，并且有明顯的軸突染色。Miro1的mRNA趨勢與蛋白表達(dá)趨勢相反。結(jié)論：癲癇動物模型在慢性期與癲癇臨床樣本一致，Miro1蛋白表達(dá)顯著降低，而在急性期，Miro1表達(dá)顯著升高，這一動態(tài)變化提示我們Miro1可能與癲癇的發(fā)病過程是息息相關(guān)的。mRNA與蛋白表達(dá)水平趨勢相反，有可能是由于急性

10、期Miro1增高通過負(fù)反饋?zhàn)饔胢RNA表達(dá)降低；而慢性期自發(fā)發(fā)作期，與人類癲癇病程相似，自發(fā)發(fā)作期線粒體自噬增強(qiáng)，Miro1降解加快。
　　第三部分 Miro1和線粒體的分布在動物模型中的研究
　　目的：探究Miro1的表達(dá)的變化是否對線粒體分布產(chǎn)生影響。方法：將大鼠分為對照組，SE3d組，SE60d組，每組8只。建立SD大鼠氯化鋰-匹羅卡品模型，在每只大鼠取腦前7天，通過立體定向注射將線粒體活性染料Mitotracker注

11、入左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)。之后取腦，做冰凍切片，免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果：綠色熒光的Miro1蛋白表達(dá)與第二部分免疫組織化學(xué)染色一致，急性期增高，慢性期降低。同時(shí)綠色熒光的位置與紅色熒光的線粒體共表達(dá)，證實(shí)我們之前結(jié)果的準(zhǔn)確性。紅色熒光的線粒體，對照組分布正常，急性期Miro1表達(dá)升高時(shí)線粒體向核周聚集，慢性期Miro1表達(dá)降低時(shí)線粒體瓦解散落。結(jié)論：該部分實(shí)驗(yàn)確實(shí)了之前部分的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)隨著Miro1蛋白表達(dá)變化線粒體分布也發(fā)生變