高產(chǎn)Mn-SOD菌株的篩選及酶的分離純化.pdf

1、從長白山溫泉邊的土壤中篩選出一株能高產(chǎn)SOD的菌株，通過抑制劑試驗(yàn)確定其所產(chǎn)SOD為Mn-SOD。該菌菌落為白色，不透明，表面光滑，邊緣呈裂葉狀，液體生長渾濁，靜置成膜，菌體為直桿狀，寬0.4nm-0.8nm，長2nm-3nm,孢子次端生，形狀橢圓，該菌種生長溫度范圍為25℃-65℃，有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏反應(yīng)陰性，M.R反應(yīng)陰性，V.R反應(yīng)陽性，能利用甘露醇和葡萄糖產(chǎn)酸而不能利用木糖產(chǎn)酸，不能在10％NaCl上生長，能在7％NaCl和5％N

2、aCl上生長，能夠水解淀粉，該菌株初步鑒定為芽孢桿菌。 在形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用PCR技術(shù)對(duì)該菌株的16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GeneBank(注冊(cè)序列號(hào)為DQ318779)并進(jìn)行Blast同源序列比對(duì)。以16SrDNA同源性為基礎(chǔ)，取同源性較高的11株芽孢桿菌和該菌株用生物軟件Clustalxl.81和Phylip做出進(jìn)化樹并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明該菌株與Bacillussp的

3、一系列菌株同源性高達(dá)99％且和Bacillussp.MO6在進(jìn)化樹上處于同一分支，據(jù)此可判斷該菌株屬于Bacillussp.，將其命名為Bacillussp.110-2。 對(duì)菌株Bacillussp.110-2進(jìn)行碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、起始PH值、接種量等發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在以玉米粉4％為碳源，以蛋白胨1％為氮源，溫度35℃，起始PH值8，添加無機(jī)鹽CaCO3(0.02％)，接種量8％，裝液量7

4、0ml/250ml的條件下培養(yǎng)20h菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。 采用金屬螯合層析和毛細(xì)管電泳兩種方法對(duì)Bacillussp.110-2進(jìn)行純化，結(jié)果表明金屬螯合層析不能將SOD的同工酶分開，毛細(xì)管電泳純化的酶純度更高，可直接進(jìn)行質(zhì)譜分析、原子吸收測(cè)定和氨基酸分析等。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，菌株Bacillussp.所產(chǎn)SOD由兩個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基分子量為25KD；酶所含金屬離子為錳；酶具有很強(qiáng)的耐堿性和較好的耐熱性，在pH=13時(shí)酶