MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)研究人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白分子結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及新功能.pdf

1、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TF)是一類含有鐵組分和糖鏈的金屬蛋白質(zhì)(80 kDa)。TF的主要生理功能是輸送鐵給細(xì)胞，或作為生物體液的抗菌因子。TF有兩個同源末端(C-和N-端)，每個末端又分為兩個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域之間形成深裂(單一、高親和力的鐵結(jié)合位點)。本論文選用梯度、不連續(xù)天然凝膠電泳制備人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(HTF)，并結(jié)合電轉(zhuǎn)移和超濾技術(shù)進(jìn)一步分離與濃縮HTF。運用SDS-PAGE、膠內(nèi)與膠外酶解、MALDI-TOF質(zhì)譜、數(shù)據(jù)

2、庫檢索和比對法等分析技術(shù)鑒定HTF。HTF(77.1 kDa) 由單類型單亞基組成，但經(jīng)天然和變性等電聚焦分離后，卻呈現(xiàn)出兩條蛋白帶，即HTF-2Fe3+和apoHTF，無其它異構(gòu)體。作者認(rèn)為正常人血清中HTF中只存在HTF-2Fe3+和apoHTF兩種分子結(jié)構(gòu)，可作為生物標(biāo)記物，用于快速篩查人群中與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)異常有關(guān)的疾病，如缺糖轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT)。 選用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析鐵飽和HTF、HTF-2Fe3+和ap

3、oHTF的穩(wěn)定性及裂解產(chǎn)物。以乙腈水溶液為洗脫相，HTF經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC，C18柱)分離過程中，產(chǎn)生了分子結(jié)構(gòu)裂解現(xiàn)象，形成了不同分子量大小的肽段。HTF分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與它結(jié)合鐵的數(shù)目有關(guān)。鐵組分在提高HTF穩(wěn)定性中扮演著重要角色。選用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析乙腈裂解HTF為肽段的規(guī)律，并初步闡明其裂解機(jī)理。在乙腈作用下，HTF可能通過蛋白質(zhì)去折疊途徑，形成不同多聚態(tài)HTF或多肽裂解產(chǎn)物，它們分別是由HTF氨基酸

4、序列中位于Ile490～Lys508或Leu619～Lys676的肽段及它們所連接的糖鏈組成。HTF裂解產(chǎn)物或多聚體的形成可能是目前在臨床診斷先天性糖基化紊亂和慢性酒精濫用疾病準(zhǔn)確率低的主要干擾因素之一。 在研究HTF作為抗腫瘤藥物載體方面，作者發(fā)現(xiàn)HTF能有效絡(luò)合抗腫瘤藥物氟尿嘧啶和順鉑，每分子的HTF可結(jié)合10～13個氟尿嘧啶分子或4-9個順鉑分子。兩種藥物與HTF間的相互作用對酸或有機(jī)溶劑敏感，如TFA和乙腈，表明是弱的