哺乳動(dòng)物Bax基因?qū)鸾z桃細(xì)胞凋亡和金絲桃苷合成的誘導(dǎo)作用及其機(jī)理研究.pdf

1、Bax基因是動(dòng)物凋亡基因Bcl-2家族中的一員，具有促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞凋亡的作用。以往研究報(bào)道表明Bax基因可以誘發(fā)模式植物細(xì)胞過敏性反應(yīng)和凋亡。為了探討哺乳動(dòng)物Bax基因?qū)λ幱弥参锛?xì)胞凋亡和細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物合成的影響，本文以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的轉(zhuǎn)小鼠Bax基因的金絲桃細(xì)胞(雌二醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)為材料，研究了小鼠Bax基因?qū)鸾z桃細(xì)胞凋亡和金絲桃苷合成的影響，并初步探討了Bax基因誘發(fā)金絲桃細(xì)胞凋亡和金絲桃苷合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如

2、下： 1、轉(zhuǎn)小鼠Bax基因金絲桃細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化 將固體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)小鼠：Bax基因金絲桃愈傷組織接種到MS培養(yǎng)液中，為獲得最優(yōu)細(xì)胞生物量和金絲桃苷含量，對(duì)培養(yǎng)液(植物激素組成、pH值和蔗糖濃度)、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量等條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了金絲桃懸浮細(xì)胞系的最適培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液為MS+1.5×10<'-5>mol·L<'-1>NAA+10<'-6>mol·L<'-1>BA+3％蔗糖，使用前pH值調(diào)至5.8，培養(yǎng)

3、溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm，接種量為3 g/50mL medium。并且在此培養(yǎng)條件下測(cè)得細(xì)胞生長(zhǎng)周期為12 d。在優(yōu)化培養(yǎng)條件的過程中，對(duì)傳代種細(xì)胞進(jìn)行Bax基因的：PCR鑒定篩選，最終獲得了生長(zhǎng)速度較快、形態(tài)比較穩(wěn)定的金絲桃誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)小鼠Bax基因懸浮細(xì)胞系。 2、小鼠Bax基因?qū)鸾z桃細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)理的初步研究 Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，添加25 μmol·L<'-1>雌二醇(E

4、st)可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)小鼠：Bax基因金絲桃細(xì)胞中Bax的穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)小鼠：Bax基因金絲桃細(xì)胞經(jīng)Est處理后，21 h時(shí)胞外培養(yǎng)液pH值開始升高；用Sytox green特異性DNA染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，24 h時(shí)就能檢測(cè)到細(xì)胞的死亡，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)死亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，在60～72 h時(shí)可以觀察到明顯的細(xì)胞染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核解體形成凋亡小體等形態(tài)學(xué)上典型的凋亡特征，而對(duì)照組細(xì)胞無上述特征。此結(jié)果表明小鼠Bax基因在金絲桃細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)可

5、以誘發(fā)細(xì)胞凋亡。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，經(jīng)Est處理48 h后的轉(zhuǎn)：Bax基因金絲桃細(xì)胞的基因組出現(xiàn)明顯的“’DNA Ladder”，而對(duì)照組細(xì)胞檢測(cè)不到“DNALadder”，表明小鼠Bax基因的誘導(dǎo)表達(dá)可以誘發(fā)核小體間的：DNA發(fā)生斷裂。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)小鼠Bax基因可以誘發(fā)金絲桃細(xì)胞凋亡。 為了探討小鼠Bax基因誘發(fā)金絲桃細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理，本文測(cè)定了金絲桃細(xì)胞中一氧化氮(NO)的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，Est處理后12

6、 h，轉(zhuǎn)基因金絲桃細(xì)胞的NO含量開始出現(xiàn)增加，并且在第25 h左右達(dá)到第一個(gè)高峰，隨后出現(xiàn)小幅下降，在大約33 h左右又開始快速增加并在40 h左右達(dá)到第二個(gè)高峰，而對(duì)照組細(xì)胞的NO含量未出現(xiàn)明顯變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠Bax基因的誘導(dǎo)表達(dá)可以誘發(fā)金絲桃細(xì)胞一NO進(jìn)發(fā)。NO專一性淬滅劑cPTIO在淬滅NO進(jìn)發(fā)的同時(shí)，也抑制了由Bax誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，說明NO是參與Bax誘發(fā)金絲桃細(xì)胞凋亡所必需的信號(hào)分子。DPI是質(zhì)膜NADPH氧化酶的專一

7、性抑制劑，可以抑制細(xì)胞的氧化進(jìn)發(fā)。本文試驗(yàn)結(jié)果表明，DPI處理雖然不能抑制Bax誘發(fā)的金絲桃細(xì)胞凋亡和核DNA斷裂，但可以推遲細(xì)胞凋亡和“DNA Ladder”的出現(xiàn)時(shí)間，說明由質(zhì)膜NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化進(jìn)發(fā)作用可能參與了Bax對(duì)金絲桃細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，但不是Bax誘發(fā)細(xì)胞凋亡的必需信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。 3、小鼠Bax基因?qū)鸾z桃苷合成的影響及其機(jī)理的初步研究 在未誘導(dǎo)Bax基因表達(dá)的前提下，轉(zhuǎn)小鼠Bax基因金絲桃懸浮細(xì)

8、胞和野生型金絲桃懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞生長(zhǎng)和金絲桃苷合成積累上沒有區(qū)別。在轉(zhuǎn)：Bax金絲桃懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)周期的不同時(shí)間段添加Est進(jìn)行Bax的誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期末期(第9 d)為促進(jìn)金絲桃苷合成積累的最佳誘導(dǎo)時(shí)期，第12 d收獲得鮮重為對(duì)照的94％，金絲桃苷含量達(dá)到了對(duì)照的2.15倍。在Bax誘導(dǎo)金絲桃苷合成的過程中，懸浮培養(yǎng)的金絲桃細(xì)胞發(fā)生了NO進(jìn)發(fā)事件。NO專一性淬滅劑cPTIO可以有效的消除Bax誘發(fā)的NO進(jìn)發(fā)，并且在一定程度上

9、抑制了Bax誘導(dǎo)金絲桃苷的合成；外源NO也可以誘導(dǎo)金絲桃細(xì)胞中金絲桃苷的合成，cPTIO能抑制外源NO誘導(dǎo)金絲桃苷的合成。此結(jié)果表明NO介導(dǎo)了一條Bax誘導(dǎo)金絲桃苷合成的信號(hào)途徑。質(zhì)膜NADPH氧化酶的專一性抑制劑DPI對(duì)Bax誘導(dǎo)金絲桃苷的合成也有一定的抑制作用。通常，在植物細(xì)胞中，質(zhì)膜NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化進(jìn)發(fā)的直接產(chǎn)物主要為H<,2>O<,2>。外源添加H<,2>O<,2>能夠有效的誘導(dǎo)金絲桃細(xì)胞中金絲桃苷的合成。過氧化氫酶(