金絲桃苷對過氧化氫誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目前，病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、缺血-再灌注肝損傷、藥物性肝病、肝癌等肝臟疾病已成為世界公共健康問題。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激通過影響酶類及受體的功能，破壞細(xì)胞膜完整性，影響細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，干擾肝臟的氧化-還原穩(wěn)態(tài)，從而參與多種肝臟疾病的病理生理過程。氧化應(yīng)激損傷臨床常采用維生素A、β-胡蘿卜素、維生素E、維生素C、GSH等還原性物質(zhì)進(jìn)行抗氧化治療。但近年發(fā)現(xiàn)，NO、H2O2等多種自由基是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，化學(xué)藥物在

2、清除過量有害自由基的同時(shí)亦會(huì)影響自由基作為信號(hào)分子的正常生理功能。因此，尋找增強(qiáng)肝細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力，促進(jìn)氧化-還原穩(wěn)態(tài)恢復(fù)的藥物，有望成為氧化性肝損傷的有效治療手段。
　　研究顯示，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路參與氧化性肝損傷修復(fù)過程中細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于該信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的特點(diǎn)，研究該通路的誘導(dǎo)劑，有望為實(shí)現(xiàn)適度、可控的氧化性肝損傷治療開辟新的途徑。
　　植物黃酮能顯著抑制病毒性肝炎

3、、藥物性肝病、肝癌等的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化能力有關(guān)，但其作用靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步闡明。金絲桃苷(Hyperoside，Hyp)屬黃酮醇苷化合物，對缺血性腦損傷、心肌損傷、肝損傷及腎損傷均有顯著保護(hù)效應(yīng)，其機(jī)制主要為抗氧化。既往研究表明，Hyp除能直接清除ROS、螯合金屬離子外，還可能增加GSH-Px、SOD、CAT等抗氧酶的活性，但對酶活性的這種調(diào)節(jié)作用是否是通過調(diào)控抗氧化基因的表

4、達(dá)實(shí)現(xiàn)的，尚未明確。
　　本研究擬以H2O2損傷的L02細(xì)胞為模型，在明確Hyp肝細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，分析抗氧化酶活性增加與基因表達(dá)的關(guān)系，探討Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在其中的調(diào)控作用。
　　研究內(nèi)容：
　　1、建立測定L02細(xì)胞內(nèi)外Hyp含量的HPLC方法，分別于加藥后0,3,6,12,24 h分析細(xì)胞內(nèi)外Hyp的含量。
　　2、建立H2O2(100μM,6 h)損傷的L02細(xì)胞模型，測定細(xì)胞活力

5、、LDH泄漏百分比、MMP、ROS清除能力和抗氧化酶SOD、HO-1的活性，分析Hyp肝細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)的時(shí)效、量效關(guān)系。
　　3、L02細(xì)胞以Hyp處理后，RT-PCR、Real-time RT-PCR分別用于分析Hyp對HO-1和Nrf2、Keap1 mRNA水平的影響；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析Hyp對HO-1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用；WB分析Hyp對Nrf2、Keap1胞漿胞核蛋白含量、MAPK磷酸化和Bach1胞核內(nèi)表達(dá)量的影響；IF分析

6、Hyp對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功建立測定L02細(xì)胞內(nèi)外Hyp濃度的HPLC方法，方法專屬性好，回收率、精密度高。隨著孵育時(shí)間的延長，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hyp量也逐漸增加。與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，細(xì)胞內(nèi)的Hyp達(dá)峰值11.88％。
　　2、Hyp(10-800μM)能明顯減弱H2O2導(dǎo)致L02細(xì)胞活力下降、LDH泄漏百分比增加、MMP和ROS清除能力降低，且效應(yīng)具有劑量依賴性。L02細(xì)胞經(jīng)Hyp(10

7、-800μM)預(yù)處理24h后，SOD、HO-1活性呈劑量依賴性地增加。時(shí)效研究結(jié)果顯示，Hyp預(yù)處理1 h，細(xì)胞ROS清除能力短暫性減弱，HO-1活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞活力變化不明顯；Hyp預(yù)處理3 h，三者較正常正常對照組無顯著差異，而后均逐漸增強(qiáng)。
　　3、與正常對照組相比，Hyp能明顯誘導(dǎo)HO-1 mRNA水平上升和蛋白表達(dá)量增加，且作用呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。Hyp處理后，L02細(xì)胞Nrf2 mRNA水平和蛋白表達(dá)量均顯著上

8、調(diào)，Nrf2核轉(zhuǎn)位增加。Hyp對Keap1 mRNA的水平無明顯調(diào)節(jié)作用。Hyp(200μM)處理細(xì)胞6 h和12 h，胞漿Keap1的表達(dá)量明顯減少，而24 h后又恢復(fù)至正常水平。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，未見Keap1在胞核中表達(dá)。
　　4、隨著Hyp(200μM)與L02細(xì)胞孵育時(shí)間的延長，ERK、P38的磷酸化水平逐漸增加，而JNK的磷酸化水平變化不明顯。ERK特異性抑制劑(PD98059)和P38特異性抑制劑(SB203580

9、)均能顯著抑制Hyp導(dǎo)致的Nrf2核轉(zhuǎn)位，而JNK抑制劑(SP600125)對其無明顯影響。
　　5、Hyp(200μM)處理細(xì)胞3 h能明顯減少胞核內(nèi)Bach1的表達(dá)量，而出核抑制劑LMB能明顯抑制Hyp的這種下調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　1、Hyp可進(jìn)入L02細(xì)胞，且隨著孵育時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)Hyp的濃度逐漸增加，于給藥后24 h達(dá)最大值。
　　2、Hyp對H2O2損傷的L02細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)。
　　3、