中國(guó)沈陽(yáng)地區(qū)孕婦和新生兒維生素D水平調(diào)查及Vitamin D-VDR通路抑制TNBS誘導(dǎo)型腸炎進(jìn)展的機(jī)制研究.pdf

1、維生素D（Vitamin D）是一種脂溶性維生素，其最重要的作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)鈣的吸收、重吸收和鈣在骨骼的沉積。發(fā)育中胎兒的鈣含量完全依賴于母體的鈣源，動(dòng)物和人類的數(shù)據(jù)研究均表明懷孕期間孕婦維生素D缺乏是對(duì)孕產(chǎn)婦、胎兒和兒童的健康產(chǎn)生不良影響的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。因此，人們?cè)絹?lái)越擔(dān)心孕婦維生素缺乏D對(duì)新生兒的影響。母體維生素D缺乏與許多胎兒和新生兒健康問(wèn)題緊密相關(guān)，如骨發(fā)育障礙、多發(fā)性硬化、癌癥、胰島素依賴型糖尿病、哮喘、子癇前期、

2、低出生體重、妊娠期糖尿病等。之前已有研究表明維生素D缺乏的風(fēng)險(xiǎn)因素包括皮膚黑色素沉積、定期使用防曬霜、母親肥胖和生活在高緯度地區(qū)，特別是在春冬季節(jié)。維生素D水平不僅受季節(jié)的影響，而且與緯度的高低、膚色及地區(qū)生活習(xí)慣緊密相關(guān)。早產(chǎn)兒患有短期和長(zhǎng)期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更大，包括身體殘疾和精神方面的障礙。在所有產(chǎn)婦維生素D缺乏的不良結(jié)果中，早產(chǎn)是最有害的。相比健康的新生兒，早產(chǎn)兒出生時(shí)25羥基維生素D(25(OH)D)血漿濃度較低。25(OH)D補(bǔ)充

3、不僅能增加孕婦骨的再吸收，同時(shí)還增強(qiáng)其新生兒的骨量。另一項(xiàng)研究動(dòng)態(tài)地比較了患有不同程度的維生素D缺乏嬰兒的骨標(biāo)記物，結(jié)果表明，除了骨鈣素外，嬰兒在最初幾個(gè)月補(bǔ)充維生素D會(huì)對(duì)骨代謝生化標(biāo)志物產(chǎn)生影響。盡管維生素D缺乏已受到全球的關(guān)注，但因緯度、季節(jié)、膚色等因素的限制，導(dǎo)致對(duì)于維生素D缺乏的研究存在局限性，并且在世界范圍內(nèi)缺乏對(duì)于中國(guó)人口維生素D缺乏的流行病學(xué)研究。因此在中國(guó)地區(qū)進(jìn)行維生素D水平的調(diào)查，探究母體維生素D缺乏對(duì)新生兒的影響是十

4、分必要的。
　　炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性的、復(fù)發(fā)與緩解反復(fù)作用的炎性胃腸道疾病，其通常表現(xiàn)為兩種主要形式:克羅恩病(Crohn disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)。越來(lái)越多的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，維生素D缺乏與炎性腸病的發(fā)生存在一定的關(guān)系，并且炎性腸病患者普遍存在維生素D缺乏。由于維生素D受體(VDR)在腸上皮細(xì)胞(IECs)高度

5、表達(dá)，因此Vitamin D/VDR信號(hào)通路很可能在慢性炎性腸病的發(fā)病機(jī)制中扮演關(guān)鍵角色。
　　腸上皮屏障由單層上皮細(xì)胞和鄰近細(xì)胞間的緊密連接組成，是腸粘膜上皮層的高度選擇性屏障，正是這種屏障在結(jié)腸炎的發(fā)生及發(fā)展中起著重要的作用。
　　目的:
　　腸上皮細(xì)胞的異常凋亡是腸道滲透率增加和腸道炎癥的一個(gè)重要病理生理機(jī)制。腸上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡會(huì)引起上皮屏障的破壞，從而導(dǎo)致腸道通透性的增加，進(jìn)而使炎癥物質(zhì)侵入。這些有害物質(zhì)可以

6、導(dǎo)致結(jié)腸固有層中炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，這一系列的惡性腸道活動(dòng)促進(jìn)了結(jié)腸炎癥的發(fā)生，最終導(dǎo)致慢性炎性腸病。最新研究表明，VDR轉(zhuǎn)基因鼠較野生型鼠的腸炎發(fā)病率低，這一研究提示VDR在腸炎的發(fā)生發(fā)展中起到了保護(hù)作用。我們的假設(shè)是，維生素D的治療能夠通過(guò)減輕腸上皮細(xì)胞的凋亡而抑制2，4，6-三硝酸苯磺酸(TNBS)誘發(fā)型腸炎的進(jìn)展。
　　方法:
　　本研究所涉及患者和正常對(duì)照人群的樣本均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院。所有樣本

7、的留取及使用均已征得本人的同意，并告知用于科學(xué)研究。本課題的研究已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)道德倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
　　一、中國(guó)沈陽(yáng)地區(qū)孕婦和新生兒維生素D水平調(diào)查
　　于2011年10月至2012年10月期間在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)科住院選擇剖宮產(chǎn)終止妊娠孕婦共1103例中選取821例。維生素D缺乏被定義為血清25(OH)D≤50 nmol/L，并進(jìn)一步分為嚴(yán)

8、重缺乏(≤25 nmol/L)和輕度缺乏(25-50nmol/L)。血清25(OH)D水平為50到75 nmol/L定義為維生素D不足。血清25(OH)D75 nmol/L以上定義為維生素D充足。血清濃度測(cè)定使用人25羥基維生素D Elisa試劑盒，同時(shí)，骨標(biāo)志物也采用相應(yīng)的Elisa試劑盒進(jìn)行測(cè)量。所有的數(shù)據(jù)均由SPSS17.0統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)應(yīng)用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）來(lái)表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)兩數(shù)據(jù)間線性關(guān)系采用一般線性

9、分析，P＜0.05為有差異。
　　二、Vitamin D/VDR信號(hào)通路抑制TNBS誘導(dǎo)型腸炎進(jìn)展的機(jī)制研究
　　人體標(biāo)本:
　　IBD組標(biāo)本來(lái)源于2011年1月至2012年12月盛京醫(yī)院消化內(nèi)鏡科的CD和UC的患者。正常組標(biāo)本來(lái)源于進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查排除CD、UC和腸道疾病的腸道健康患者（對(duì)照組為22例，UC組12例，CD組為13例）。
　　腸炎誘導(dǎo):
　　本次實(shí)驗(yàn)用TNBS注射致腸炎模型，實(shí)驗(yàn)采用雄性成年C

10、57BL6/J小鼠進(jìn)行動(dòng)物模型建立，體重為20-25g。腹腔注射雞尾酒麻醉藥物使小鼠麻醉后，用18號(hào)不銹鋼注射器經(jīng)肛進(jìn)行不同劑量同濃度TNBS結(jié)腸注射(TNBS，用50％乙醇溶解)，治療不同劑量同濃度的TNBS經(jīng)推入小鼠結(jié)腸(100mg/kg)，對(duì)照組使用不含TNBS同體積的50％酒精，每組16只小鼠。
　　維生素D治療及分組:
　　TNBS組和對(duì)照組分別隨機(jī)分成兩組（共四組，每組8只）:一組進(jìn)行維生素D的類似物帕立骨化醇(

11、paricalcitol)進(jìn)行腹腔注射治療，將帕立骨化醇按(90∶10的比例)溶入丙二醇，劑量為0.5μg/kg;另外一組只不含藥物的同劑量丙二醇。時(shí)間點(diǎn)選為TNBS注射時(shí)間的30分鐘前一次，之后1天、3天、5天各注射一次，共4次。分組情況:TNBS+ vehicle組（VE組:安慰劑組），TNBS+vitamin D組(VD組:維生素D治療組)，control+vehicle組和control+vitamin D組。
　　實(shí)驗(yàn)方

12、法
　　利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和蛋白印跡(Western Blot)檢測(cè)對(duì)照組和IBD患者組中腸組織的VDR蛋白和基因表達(dá)，檢驗(yàn)TNBS模型中TNF-α、IFNγ、IL-17、IL23、IL1β、IL6、MCP-1和B2M基因的表達(dá)和p53，P53正向細(xì)胞凋亡調(diào)控因子(PUMA)和Caspase3蛋白表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)

13、進(jìn)行定量與比較分析。利用ELISA方法測(cè)量對(duì)照組和IBD患者組血清中25(OH)D水平，并比較分析。利用FD4對(duì)TNBS模型中四組腸管進(jìn)行通透性測(cè)定，并比較分析。
　　結(jié)果:
　　一、中國(guó)沈陽(yáng)地區(qū)孕婦和新生兒維生素D水平調(diào)查
　　對(duì)母體維生素D水平與新生兒維生素D水平進(jìn)行一般線性分析，兩者呈強(qiáng)正相關(guān)(r=0.684，P=0.000)。在春季和夏季孕婦25(OH)D水平有顯著性差異(P＜0.0001)，同時(shí)春季和秋季之間

14、差異明顯(P＜0.01)。與其他季節(jié)相比，冬季25(OH)D水平最低(夏季vs冬季P＜0.0001，秋季vs冬季P＜0.0001)。母體維生素D水平顯示呈明顯的月和季節(jié)變化，夏季最高，冬季最低。嚴(yán)重早產(chǎn)組與足月產(chǎn)組、重度早產(chǎn)組與輕度早產(chǎn)組中的維生素D水平之間存在著顯著差異（重度早產(chǎn)vs輕度早產(chǎn)P＜0.01，重度早產(chǎn)vs足月產(chǎn)＜0.001）。重度早產(chǎn)組中63.04％患有維生素D缺乏，高于足月產(chǎn)組(36.61％)。孕婦血清中CTX、OPG、

15、OPN、PYD的濃度與其25(OH)D濃度均呈正相關(guān)(r=0623，0.655，0.697和0.721，all P=0.000)。新生兒血清中CTX、OPG、OPN、PYD的濃度與其25(OH)D濃度均呈正相關(guān)(r=0623，0.655，0.697和0.721, all p=0.000)
　　二、Vitamin D/VDR信號(hào)通路抑制TNBS誘導(dǎo)型腸炎進(jìn)展的機(jī)制研究
　　本研究證實(shí)IBD患者中，CD組和UC組的25(OH)D

16、水平明顯低于對(duì)照組。Western Blot顯示VDR在UC組、CD組的含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，同時(shí)VDR基因在UC組和CD組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。我們用TNBS建立小鼠腸炎模型來(lái)模仿IBD的病理過(guò)程，VD組小鼠體重減輕較少。VE組腸管出現(xiàn)嚴(yán)重的出血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及正常上皮屏障的破壞，VD組小鼠腸道組織學(xué)損傷較輕。VE組炎性因子和趨化因子的mRNA的表達(dá)較VD組明顯升高，說(shuō)明Vitamin D對(duì)炎癥有抑制作

17、用。VD組FD4的血清水平明顯低于VE組(p＜0.05)。Westemblot顯示帕立骨化醇的治療使VD組中caspase-3和PUMA的表達(dá)較VE組顯著減弱(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、沈陽(yáng)地區(qū)孕婦及其新生兒維生素D的狀況與同緯度地區(qū)相比較好。孕婦維生素D缺乏在冬季最嚴(yán)重，在夏季最輕。嚴(yán)重早產(chǎn)的妊娠孕婦維生素D缺乏較重。
　　2、Vitamin D通過(guò)Vitamin D/VDR通路下調(diào)PUMA，降低腸上皮細(xì)