醇質體促水溶性藥物經皮滲透的機制研究.pdf

1、本研究以羅丹明B模擬水溶性藥物，用NBD-PC標記卵磷脂以示蹤磷脂在皮膚中位置;通過制備并篩選羅丹明B醇質體的最佳處方，對其理化性質進行考察;采用CLSM研究羅丹明B醇質體的在體經皮滲透過程及促進水溶性藥物經皮滲透的機制;并通過TEM研究醇質體與大鼠皮膚相互作用后超微結構的改變。
　　目的：
　　研究醇質體促進水溶性藥物經皮滲透的機制及對皮膚超微結構的影響，從而為醇質體經皮制劑的后續(xù)研發(fā)提供詳實的實驗數(shù)據支撐并奠定堅實的理論

2、基礎。
　　方法：
　　1、采用正交實驗設計L9(34)表制定0.02％羅丹明B醇質體的組方
　　以蛋黃卵磷脂質量分數(shù)、無水乙醇的體積分數(shù)和超聲時間為考察因素，以平均粒徑值作為衡量指標確定0.02％羅丹明B醇質體最佳處方;
　　2、羅丹明B醇質體、脂質體的制備
　　2.1 采用注射超聲法制備羅丹明B醇質體:
　　用分析天平稱取處方量的蛋黃卵磷脂和羅丹明B。蛋黃卵磷脂置于玻璃瓶中用乙醇溶解，并用磁力攪拌

3、器攪拌均勻，羅丹明B用雙蒸水溶解。然后使玻璃瓶與注射器密封連接，允許加入乙醇而避免乙醇揮發(fā)。羅丹明B溶解后以200μL·min-1的流速加入卵磷脂乙醇溶液中并以700r·min-1的轉速用磁力攪拌器攪拌，藥物注入后，再攪拌5min，最后采用探頭式超聲儀以150W的功率冰水浴條件下超聲5min;
　　2.2 采用薄膜擴散超聲法制備羅丹明B脂質體:
　　精密稱取處方量的蛋黃卵磷脂(2％，w/v)并置于圓底燒瓶中，加適量的氯仿溶解

4、，圓底燒瓶連接到旋轉蒸發(fā)儀上，60℃真空條件下旋轉蒸發(fā)除去氯仿，直至在燒瓶壁上形成一層均勻的薄膜，真空下過夜以除去殘余的氯仿，然后用羅丹明B(0.02％，w/v)水溶液在室溫下震蕩水化薄膜30min。所得混懸液采用探頭式超聲儀以150W的功率冰水浴條件下超聲5min以均一化粒徑;
　　2.3 NBD-PC標記0.03％羅丹明B醇質體的制備:
　　采用前述方法制備，只是在磷脂中加入處方量的NBD-PC（磷脂與NBD-PC的摩爾

5、比為100∶1）;
　　2.4 未包封的羅丹明B的分離:
　　使用Amicon Ultra-4(Millipore Corporation，USA)超濾管(截留分子量為3000Da)分離未包封的羅丹明B。取制備的NBD-PC標記的羅丹明B醇質體4mL注入超濾管內，4℃下以12000Xg的離心力離心1h，濾過液丟棄，沉淀管轉入一個新的收集管，4℃下以1000Xg的離心力離心5min以獲得無游離羅丹明B的NBD-PC標記的羅丹明

6、B醇質體。為了防止熒光淬滅，獲得的制劑立即用于皮膚滲透實驗;
　　3、采用馬爾文粒徑儀檢測羅丹明B醇質體、脂質體的粒徑及電荷
　　采用馬爾文粒徑儀測定醇質體和脂質體的平均粒徑和電荷，激光束波長633nm，入射與散射光夾角90°，溫度25℃。分別以制備時相同濃度的乙醇溶液和雙蒸水稀釋醇質體和脂質體至一定濃度后測定，每個樣品重復測定三次;
　　4、采用透射電鏡觀察羅丹明B醇質體的形態(tài)
　　羅丹明B醇質體用制備時相同濃

7、度的乙醇溶液稀釋后，水浴超聲30min。取適量制劑滴于銅網上，并用2％磷鎢酸負染，用濾紙吸去多余的染液，用透射電鏡在80KV的加速電壓下觀察粒子形態(tài);
　　5、通過溫度和時間的變化來考察0.02％羅丹明B醇質體的穩(wěn)定性
　　分別將0.02％羅丹明B醇質體存放于4±1℃和25±1℃條件下90d后，采用馬爾文粒徑儀測定0.02％羅丹明B醇質體的粒徑來評價羅丹明B醇質體的穩(wěn)定性;
　　6、羅丹明B醇質體的在體經皮滲透

8、　　采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠隨機分為4組(n=6)。在體經皮實驗前使用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，然后用電動剃毛刀剃去腹部毛發(fā)，避免傷及皮膚并用生理鹽水清潔皮膚。待腹部皮膚干燥后，用氰基丙烯酸鹽粘合劑把面積為0.64cm2的玻璃圓柱粘附在豚鼠腹部皮膚作為給藥池，在給藥過程中玻璃圓柱保持水平。把200μ L的各種制劑加入玻璃圓柱內，使用透明薄膜覆蓋以防止蒸發(fā)，整個實驗過程中嚴格避光。每組大鼠中的三只分別于設定的1，4，8h時間點采用頸椎脫臼法

9、處死大鼠，用紗布清除多余的制劑，再用生理鹽水清洗給藥部位皮膚至少3次。接著使用手術刀及剪刀切下給藥區(qū)域皮膚并剔除皮下脂肪，所取皮膚組織立即用于制作冰凍切片。而每組中的另外三只大鼠在給藥8h后，用紗布清除多余的制劑，生理鹽水清洗給藥皮膚至少3次。并在清除藥物后的1，4，8h時間點采用頸椎脫臼法處理大鼠，并以相同的方法處理給藥部位皮膚;
　　7、醇質體促進水溶性藥物的經皮滲透機制研究
　　采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠隨機分為三組(

10、n=3)。在體經皮實驗前使用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，然后用電動剃毛刀剃去腹部毛發(fā)，避免傷及皮膚并用生理鹽水清潔皮膚。待腹部皮膚干燥后，用氰基丙烯酸鹽粘合劑把面積為0.64cm2的玻璃圓柱粘附在豚鼠腹部皮膚作為給藥池，在給藥過程中圓柱保持水平。把200μL的NBD-PC標記羅丹明B醇質體加入玻璃圓柱內，使用透明薄膜覆蓋以防止蒸發(fā)，整個實驗過程中嚴格避光。分別于設定的1，4，8h時間點采用頸椎脫臼法處死大鼠，用紗布清除多余的制劑，再用生理鹽水

11、清洗給藥部位皮膚至少3次。接著使用手術刀取下給藥區(qū)域皮膚并剔除皮下脂肪，所取皮膚組織立即用于制作冰凍切片;
　　8、皮膚組織冰凍切片的制備
　　采用冰凍切片結合CLSM分析技術來觀察各制劑透皮后各熒光素在皮膚內各層的分布。把各時間點取下的皮膚標本放在冰凍切片機的樣品托上，加適量OCT于-20℃溫度下對樣品進行冷凍。切片厚度為8μm，用防脫載玻片貼片，無水甘油封片。及時用CLSM觀察各熒光素在皮膚內的分布;
　　9、皮膚

12、組織超薄切片制備
　　使用TEM觀察給藥部位皮膚的超微結構的改變，并以正常皮膚作對照。皮膚標本切成2×4mm2大小，2.5％的戊二醛4℃下固定過夜，1％的四氧化鋨固定2h，然后用(35％，50％，70％，95％，和100％)的梯度酒精脫水，最后樹脂包埋并在70℃下孵育8h。使用超薄切片機切片，切片置于銅網上，然后使用醋酸鈾和檸檬酸鉛負染，采用TEM觀察拍照;
　　10、激光共聚焦顯微鏡掃瞄皮膚組織冰凍切片
　　各時間點

13、組織切片內熒光素的分布采用CLSM進行觀察。CLSM的各項參數(shù)在掃描中保持一致，羅丹明B用波長為568nm的氪激光激發(fā)，發(fā)射熒光為紅色，NBD-PC用波長為488nm的氬激光激光，發(fā)射的熒光為綠色，物鏡為30倍。各切片的平均熒光強度及熒光面積使用Image-Pro Plus軟件進行分析，然后對平均熒光強度及平均熒光面積作時間圖。同時對各熒光圖像進行皮膚自身熒光校正;
　　11、數(shù)據統(tǒng)計與分析
　　采用SPSS13.0軟件對數(shù)

14、據進行統(tǒng)計學分析。兩樣本均數(shù)間的比較用T檢驗，多組樣本均數(shù)之間的比較:當滿足方差齊性時，使用單向方差分析和樣本均數(shù)間的多重比較（LSD法）;當不滿足方差齊性時使用近似F檢驗(Welch檢驗方法)及校正的多重比較方法(Dunnett's T3)。并使用Origin7.5繪制統(tǒng)計圖。當P＜0.05時視為具有顯著的統(tǒng)計學差異。結果中數(shù)據以(X)±S表示;
　　結果：
　　1、根據正交試驗設計結果，確定0.02％羅丹明B醇質體的最佳

15、處方為:35％(v/v)無水乙醇，2％(w/v)蛋黃卵磷脂，0.02％(w/v)羅丹明B;影響羅丹明B醇質體粒徑的主次因素順序為:無水乙醇濃度＞蛋黃卵磷脂濃度＞超聲時間;根據最佳處方制備的羅丹明B醇質體的粒徑為:113.5±2.3nm(n=3);
　　2、透射電鏡(TEM)觀察0.02％羅丹明B醇質體的形態(tài)為大小較為均一的圓形小球;
　　3、馬爾文動態(tài)激光粒度儀(Malvern)測得0.02％羅丹明B醇質體的大小為:113.

16、5±2.3nm(n=3)，多分散指數(shù)(PDI)為0.132±0.035(n=3)，電荷為-19.5±2.3mV(n=3);
　　4、將0.02％羅丹明B醇質體保存于不同溫度并于90d之后測定其粒徑，結果顯示:醇質體在4±1℃條件下的粒徑發(fā)生了顯著性變化(P=0.000)，但在25±1℃條件下，羅丹明B醇質體的粒徑變化不顯著(P=0.126);
　　5、平均熒光面積和強度代表各種制劑進入皮膚內的深度和量。制劑經皮滲透1h后，羅

17、丹明B醇質體組可見在角質層和淺層毛囊有較明亮的紅色熒光。羅丹明B醇質體組的平均熒光面積和平均熒光強度與羅丹明B脂質體、醇水溶液、水溶液相比具有顯著差異性(P=0.000)，但羅丹明B脂質體與羅丹明B醇水溶液平均熒光面積(P=0.908)和平均熒光強度(P=0.863)均無統(tǒng)計學差異。4h后羅丹明B醇質體組紅色熒光分布在深層毛囊及真皮深層。羅丹明B醇質體與其余制劑的熒光面積和平均熒光強度比較具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)，羅丹明B脂質體

18、與醇水溶液的平均熒光面積(P=0.002)和平均熒光密度(P=0.001)亦有統(tǒng)計學差異。8h時羅丹明B醇質體在真皮深層的紅色熒光亮度更強。醇質體與其余制劑的熒光面積和平均熒光強度比較具有統(tǒng)計學差異(P=0.000)。各種制劑經皮給藥8h后去除皮膚表面多余的制劑后皮膚內熒光逐漸減弱，去除藥物1h后羅丹明B醇質體組可見紅色熒光分布在角質層、真皮淺層、毛囊內，真皮深層無紅色熒光。醇質體與脂質體(P=0.000)、醇水溶液(P=0.001)、

19、水溶液(P=0.000)的平均熒光面積相比有顯著統(tǒng)計學差異，平均熒光強度亦有統(tǒng)計學差異(P=0.000)。4h后羅丹明B醇質體在淺層毛囊和角質層可見明亮紅色熒光，醇質體與與脂質體(P=0.000)、醇水溶液(P=0.002)、水溶液(P=0.000)的平均熒光面積相比有顯著統(tǒng)計學差異，平均熒光強度亦有統(tǒng)計學差異(P=0.000)。8h時羅丹明B醇質體在角質層可見少量紅色熒光分布，醇質體與其余制劑的平均熒光面積相比有顯著統(tǒng)計學差異(P=0

20、.000)，與脂質體(P=0.000)、醇水溶液(P=0.002)、水溶液(P=0.000)的平均熒光強度相比亦有統(tǒng)計學差異;
　　6、使用CLSM觀察羅丹明B和NBD-PC在皮膚內的分布情況。制劑經皮1h時皮膚淺層毛囊內可見明亮綠色熒光，且毛干內充滿綠色熒光，而皮膚角質層的綠色熒光很弱;紅色熒光在角質層成較暗的帶狀分布，皮膚淺層毛囊亦有較弱紅色熒光分布，但毛干中央未見紅色熒光。4h時在皮膚深層的毛囊可見綠色熒光分布，角質層的綠色

21、熒光較強且呈帶狀分布，此時紅色熒光在角質層呈明亮的帶狀分布，皮膚淺層毛囊的紅色熒光逐漸增強，皮膚深層的毛囊也開始出現(xiàn)紅色熒光。8h時綠色熒光依然分布在角質層和毛囊內，但紅色熒光除了分布在角質層和毛囊外，在活性表皮層亦可見分布，而在真皮層分布不明顯;
　　7、采用TEM研究NBD-PC標記羅丹明B醇質體與皮膚相互作用后皮膚超微結構的改變。由正常對照皮膚的TEM圖像可知，皮膚角質層結構緊密，角質細胞扁平，活性表皮層可見橋粒分布，基底膜

22、帶結構完整，可見清晰的半橋粒。NBD-PC標記羅丹明B醇質體在大鼠腹部皮膚經皮應用4h的電鏡圖顯示:角質細胞腫脹變大，角質橋粒斷裂導致角質層整體結構疏松，角質細胞間間隙明顯增寬，角質層不同深度均可見完整的脂質囊泡，部分囊泡崩解破裂成脂質碎片分布在角質細胞間，角質層深層的疏松度較淺層明下降，顆粒層結構未見改變，細胞間橋粒完整，未見脂質囊泡和脂質碎片分布，真皮乳頭層基底膜結構完整，未見半橋粒破壞;
　　結論：
　　1、0.02％

23、的羅丹明B醇質體為大小較為均一的圓形小球，粒徑小，分散指數(shù)小，帶負電荷，在25±1℃下保存穩(wěn)定性好;
　　2、在體經皮滲透試驗結果表明:醇質體的在體經皮滲透時滯短，其在皮膚內的滲透深度及滲透量均顯著高于脂質體、醇水溶液和水溶液。醇質體在皮膚內的儲留時間長于脂質體、醇水溶液、水溶液;
　　3、醇質體經皮給藥時一部分囊泡迅速分布至毛囊區(qū)，且由毛囊淺層向深層及毛囊周圍滲透，其余的醇質體則通過角質細胞間進入角質層;
　　4、醇