N,N-二(2-氯乙基)-芥酸酰胺逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞BEL-7404耐藥及其逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本研究的研究對(duì)象為人肝癌細(xì)胞BEL-7404經(jīng)多柔比星誘導(dǎo)建立的人肝癌BEL-7404多柔比星耐藥細(xì)胞，觀察N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺對(duì)人肝癌耐藥細(xì)胞的作用并探討其可能存在的逆轉(zhuǎn)腫瘤BEL-7404耐藥機(jī)制。
　　方法：1.耐藥細(xì)胞系的建立
　　誘導(dǎo)建立人肝癌BEL-7404細(xì)胞多柔比星耐藥細(xì)胞株時(shí)應(yīng)用大劑量沖擊和濃度梯度遞增間隙作用結(jié)合方法，應(yīng)用MTT法測(cè)定該耐藥細(xì)胞株與其凍存3個(gè)月后的耐藥指數(shù)以檢測(cè)該耐藥細(xì)

2、胞株的耐藥穩(wěn)定性；RT-PCR法檢測(cè)親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞的ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1、GST-πmRNA的表達(dá)。
　　2. N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞BEL-7404耐藥機(jī)制的研究
　　（1）采用MTT法測(cè)定N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺、維拉帕米與ADM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的藥物濃度。并計(jì)算N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺協(xié)同多柔比星對(duì)耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。
　?。?）應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)法觀

3、察N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺、N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺與ADM聯(lián)合應(yīng)用下BEL-7404/ADM細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）的表達(dá)。
　?。?）應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺作用下、N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺與ADM聯(lián)合應(yīng)用下BEL-7404/ADM細(xì)胞的ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1、GST-πmRNA的表達(dá)，以初步探討N，N－二(2-氯乙基)

4、－芥酸酰胺逆轉(zhuǎn)BEL-7404/ADM細(xì)胞耐藥的機(jī)制。
　?。?）Western blot法檢測(cè)N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺作用后耐藥細(xì)胞GST-π的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.成功建立了人肝癌BEL-7404細(xì)胞多柔比星耐藥細(xì)胞株BEL-7404/ADM，BEL-7404/ADM細(xì)胞的耐藥指數(shù)(RI)為15.4091；凍存3個(gè)月復(fù)蘇后,多柔比星對(duì)BEL-7404/ADM的IC50為（28.3103±0.67）μg/ml,R

5、I值為12.54，該耐藥細(xì)胞株具有相對(duì)穩(wěn)定的耐藥性（P>0.05）；BEL-7404/ADM細(xì)胞中ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1、GST-π基因的表達(dá)均顯著高于親本BEL-7404細(xì)胞（P<0.05）。
　　2.(1) N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺對(duì)BEL-7404耐藥細(xì)胞的無毒劑量為250μg/ml，ADM對(duì)BEL-7404/ADM的IC50為（34.7880±3.83）μg/ml；N，N－二(2-氯乙基)－芥

6、酸酰胺聯(lián)合ADM后對(duì)ADM的IC50為(10.8238±0.27)μg/ml，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.214。
　?。?）細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示：N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組可下調(diào)BEL-7404/ADM中GST-π的表達(dá)（P<0.05），與親本細(xì)胞對(duì)照組、耐藥細(xì)胞對(duì)照組相比給以N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組GST-π蛋白的表達(dá)低于耐藥細(xì)胞對(duì)照組但是高于親本細(xì)胞對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而對(duì)GST-α

7、、ABCC1/MRP1蛋白表達(dá)無影響（P>0.05）。
　?。?）RT-PCR結(jié)果顯示：N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組可下調(diào)BEL-7404/ADM中GST-πmRNA的表達(dá)，與親本細(xì)胞對(duì)照組、耐藥細(xì)胞對(duì)照組相比給以N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組GST-πmRNA的表達(dá)低于耐藥細(xì)胞對(duì)照組但是高于親本細(xì)胞對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與單用N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組、單用ADM組相比，聯(lián)用組ABC

8、C1/MRP1、ABCB1/Pg-p mRNA表達(dá)無明顯變化，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　(4) Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示： N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組可下調(diào)BEL-7404/ADM中GST-π蛋白的表達(dá)（P<0.05），與親本細(xì)胞對(duì)照組、耐藥細(xì)胞對(duì)照組相比給以N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺組GST-π蛋白的表達(dá)低于耐藥細(xì)胞對(duì)照組但是高于親本細(xì)胞對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

9、。
　　結(jié)論：1.采用濃度梯度遞增間隙作用與大劑量沖擊結(jié)合方法誘導(dǎo)建立人肝癌BEL-7404細(xì)胞ADM耐藥細(xì)胞株，該耐藥細(xì)胞株的耐藥機(jī)制與ABCB1/Pg-p、ABCC1/MRP1過量表達(dá)有關(guān)，使用二者結(jié)合方法建立的耐藥細(xì)胞株耐藥性相對(duì)比較穩(wěn)定。
　　2. N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺抑制BEL-7404/ADM細(xì)胞增殖的作用不夠顯著，無細(xì)胞毒作用的N，N－二(2-氯乙基)－芥酸酰胺與ADM聯(lián)合應(yīng)用可顯著增加BEL-7