N-(1-苯乙基)-3-(2-呋喃基)丙烯酰胺對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響.pdf

1、炎癥反應(yīng)是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)各種損傷因子的刺激所發(fā)生的一種防御機(jī)制，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)有利于激活免疫系統(tǒng)清除病原體，并可促進(jìn)組織愈合；反應(yīng)不足導(dǎo)致免疫缺陷，這可能引起感染和癌癥；反應(yīng)過(guò)度會(huì)增加多種疾病的發(fā)病率和死亡率，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性腸炎等。
　　脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分，可以刺激巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生一系列致炎因子如腫瘤壞死因子-(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1

2、(IL-1)、IL-6、IL-8等表達(dá)[1-3]。大量實(shí)驗(yàn)表明，在LPS所致的炎癥因子表達(dá)中，細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路如MAPK(mitogen-activated protein kinase)通路，NF-κB通路起重要作用[4-7]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase，MAPK)是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過(guò)程。在細(xì)胞

3、內(nèi)以MAPKKK／MAPKK／MAPK為主干，再加上各種上游影響因子和下游作用底物，構(gòu)成了一個(gè)功能多樣、反應(yīng)靈敏的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。這些與細(xì)胞信號(hào)相關(guān)的酶把細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生變化[10-14]。而p38是MAPK通路中重要成員之一，與TNF-α、IL-1等致炎因子的誘生關(guān)系密切[15,16]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是LPS介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的下游通路，在多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)調(diào)控中均具有重要作用。NF-κB

4、的激活涉及IKB(NF-κB抑制劑)的磷酸化，而后者有賴(lài)于IKK(IκB激酶)的調(diào)控，IKK/IκB/NF-κB是一個(gè)有機(jī)聯(lián)系的系統(tǒng)，該信號(hào)通路在機(jī)體發(fā)揮重要作用[17-20]。
　　體液因素或細(xì)胞因子的自分泌和旁分泌影響抗炎或炎性介質(zhì)釋放，神經(jīng)及其遞質(zhì)也有直接調(diào)節(jié)作用[21]。2000年，Nature雜志報(bào)道乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)與巨噬細(xì)胞上尼古丁受體結(jié)合能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性因子TNF-α，IL-1β

5、，IL-6，IL-18等分泌[22]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿的作用主要是通過(guò)與巨噬細(xì)胞上的α7煙堿型乙酰膽堿（α7-nAChR）受體結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)傳遞，最終抑制了Jak2-STAT3和NF-κB信號(hào)的激活，從而抑制了炎性因子的產(chǎn)生。由于乙酰膽堿是迷走神經(jīng)末梢分泌的主要神經(jīng)遞質(zhì)，他們把這條通路命名為“膽堿能抗炎通路”(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)。有研究表明α7-nAC

6、hR在該通路中起關(guān)鍵作用，它被激活后明顯抑制免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子如TNFα、IL-12、高遷移率族蛋白1（high-mobility group box1,HMGB1）等，這些是α7nAChR介導(dǎo)抗炎作用的主要機(jī)制，與此同時(shí)它還可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ,TGFβ）、IL-10等抗炎因子的產(chǎn)生[23]。因此，對(duì)α7nAChR的激動(dòng)劑的研究可為新型抗炎藥物的開(kāi)發(fā)提供可能性。本文所涉及的化

7、合物GX-50則通過(guò)生物信息學(xué)計(jì)算發(fā)現(xiàn)一種潛在的α7nAChR激動(dòng)劑，而N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺是將GX-50進(jìn)行部分化學(xué)修飾所得，我們希望能通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)這種化合物進(jìn)行研究，為找到一種新型的抗炎藥物奠定基礎(chǔ)。
　　本研究的目的就是想探討N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺對(duì)于巨噬細(xì)胞Ana-1分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-1的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)首先用不同濃度的N-(1-苯乙基）-3

8、-(2-呋喃基）丙烯酰胺處理巨噬細(xì)胞Ana-1，用MTT和LDH的方法進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)，篩選出對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的1μM的N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。接下來(lái)分別設(shè)計(jì)control（只加1640培養(yǎng)基）組，只加N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺組，先用1μM的N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺濃度預(yù)處理Ana-130分鐘，再加入LPS刺激4小時(shí)組，只加LPS處理4小時(shí)組共4組實(shí)驗(yàn)。分別收

9、集上清和細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)和RNA用于ELISA和PCR方法檢測(cè)各組TNF-α和IL-1的基因表達(dá)量, Western檢測(cè) IKK,IκB,p38的磷酸化蛋白量以及EMSA的方法檢測(cè)NF-κB的活化程度。最后用受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺與α7煙堿型乙酰膽堿受體的結(jié)合能力。
　　結(jié)果顯示，N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF-α分泌有顯著的抑制作用，其

10、分泌量約比未經(jīng)化合物A預(yù)處理的分泌量的下降了50％左右，對(duì)IL-1分泌的抑制作用不明顯。在P38MAPK通路中和在NF-κB通路中，N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺預(yù)處理再用LPS處理組比只用LPS處理組p38和IKK、IκB的蛋白磷酸化程度分別下降了約29.8%，約27.7%和約58.8%。EMSA結(jié)果也表明，N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺預(yù)處理再用LPS刺激組比只用LPS刺激組NF-κB活化程度明顯下降

11、。而α7nAChR受體特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)也表明N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺可能是α7nAChR的潛在激動(dòng)劑。
　　通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)證明了N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺對(duì)巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子TNF-α有顯著抑制作用，其機(jī)制可能主要通過(guò)抑制了LPS刺激的P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路活化起到抗炎作用。而N-(1-苯乙基）-3-(2-呋喃基）丙烯酰胺α7nAChR良好的結(jié)合，也暗示了膽堿能抗炎通路可能也參