移植肝損傷與腸道微生態(tài)相互作用的研究.pdf

1、肝臟移植目前已成為公認的治療肝硬化、肝癌和肝衰竭等終末期肝臟疾病的最有效手段，也是治療原發(fā)性肝癌的根治性方法。目前，肝移植患者的1年生存率大約為90％，而5年生存率為75％。據(jù)美國器官資源共享網(wǎng)絡(UNOS)的統(tǒng)計，截止2014年8月8日，僅僅美國已有肝移植受者累積總數(shù)達到128894例。截至目前，我國已累計實施肝移植26600多例，已成為繼美國后世界第二大肝移植大國。我國每年等待肝移植的患者已超過30萬人，是世界上潛在肝移植需求者最多

2、的國家。
　　人體腸道內(nèi)定植著數(shù)目龐大(1014)、結構復雜（超過1000種細菌)的微生物群落（約1.5公斤）。其細胞總量幾乎是人體自身細胞數(shù)量的10倍，基因總量是人類自身基因的100倍，從營養(yǎng)、代謝、免疫等諸多方面影響人體健康。近10年來，腸道微生態(tài)在人體中的作用得到國際上前所未有的重視。腸道微生態(tài)與機體存在共生關系，是人體最為重要的微生態(tài)系統(tǒng)，是人體不可缺少的重要組成部分，相當于一個重要的代謝“器官”。腸道微生態(tài)是一個復雜的系

3、統(tǒng)，包含2000多種微生物，在食物的消化吸收、維生素的合成、機體的免疫反應、代謝水平、抵抗致病菌定植等多個方面影響人體健康。腸道微生態(tài)與人體的健康和疾病密切相關，其作為新的藥物靶點將是科學發(fā)展的趨勢。腸道菌群和宿主共生并共進化過程中，在調(diào)節(jié)宿主的消化吸收、免疫反應、代謝等方面發(fā)揮重要作用。
　　腸道微生態(tài)動態(tài)平衡的破壞可促進許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括肝臟疾病。由于肝臟與腸道緊密的解剖與功能關系，腸道微生物在腸道中與宿主相互作用，通

4、過肝-腸循環(huán)和微生態(tài)-肝臟軸，在肝臟炎癥、損傷、慢性纖維化、肝硬化及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。肝臟炎癥和疾病（包括酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝病和肝硬化等）往往伴隨腸道滲透能力和微生態(tài)的改變;在疾病狀態(tài)下，腸道微生態(tài)的紊亂可促進肝臟慢性炎癥，導致肝臟大量慢性纖維化，進而促進腫瘤形成。
　　在肝移植的手術過程中，移植肝和受者腸道不可避免的遭受缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，I/R)損傷;而缺血損傷

5、的肝臟和腸道很可能引起腸道微生態(tài)的失衡，進而破壞原有的穩(wěn)定的腸道微生態(tài)與宿主的共生關系，加重移植肝損傷和失功能。同時，在肝移植中，移植物的I/R損傷和移植排斥損傷是移植物失功能的兩大主要原因?！案?腸軸”和“肝臟-微生態(tài)軸”緊密聯(lián)系著肝臟功能和腸道功能，因而肝移植中移植肝損傷與腸道微生態(tài)變化緊密相關。在肝移植術后，移植受體前三個月的第一位直接死亡原因是感染，感染的病原菌大部分來源于腸道，主要包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲等，發(fā)生率為53％

6、～79％，并且目前還沒有很好的策略能夠有效地控制肝移植術后的感染。因而，深入探討肝移植后移植肝I/R損傷與腸道微生態(tài)變化的互作關系，以及肝移植后急性排斥損傷與腸道微生態(tài)變化的關系，對于肝移植術后改善移植肝功能、減輕移植排斥反應、降低肝移植術后感染率、減少肝移植后慢性移植肝失功能、提高肝移植患者長期存活和生活質(zhì)量具有重大意義。
　　在本研究中，我們圍繞“移植肝損傷與腸道微生態(tài)相互作用”為主題，分為兩部分進行詳細闡述:(1)移植肝缺血

7、再灌注損傷的改善促進肝移植后腸道微生態(tài)恢復的研究;(2)移植肝急性排斥損傷的發(fā)生發(fā)展與肝移植后腸道微生態(tài)變化的關系。
　　第一部分 移植肝缺血再灌注損傷的改善促進肝移植腸道微生態(tài)恢復
　　研究目的:
　　缺血再灌注損傷與腸道微生態(tài)失調(diào)緊密相關。在健康和疾病中，肝-腸軸緊密聯(lián)系著肝臟功能和腸道功能。缺血預處理可以減輕外科手術中的缺血再灌注損傷。本研究旨在探討供肝缺血預處理對腸道微生態(tài)的影響，并分析大鼠肝移植后腸道微生態(tài)結

8、構轉變的特征。
　　研究方法:
　　分別建立供肝和腸道缺血預處理的肝移植動物模型。檢測移植肝病理和血清ALT/AST水平來反應移植肝的結構和功能;檢測腸道粘膜超微結構、血清內(nèi)毒素水平、細菌移位、糞便分泌型IgA含量和血清TNF-α水平來評估腸道屏障功能;實時定量PCR檢測腸道優(yōu)勢菌群的變化;采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)來描述腸道微生態(tài)的組成和變化，并使用測序分析來鑒定差異的菌群。
　　研究結果:
　　肝臟缺血

9、預處理可以改善肝移植后移植肝的功能，表現(xiàn)為:改善移植肝結構、降低血清ALT/AST水平。肝臟缺血預處理也改善腸道粘膜屏障的完整性，減弱腸道微絨毛的脫落和損傷，減輕腸道緊密連接的破壞。同時，血漿內(nèi)毒素水平輕微下降，糞便上清sIgA含量明顯升高，血漿TNF-α水平明顯降低。RT-PCR對腸道優(yōu)勢菌群分析發(fā)現(xiàn)，肝移植早期存在明顯的腸道微生態(tài)紊亂，表現(xiàn)為在細菌屬的水平上，Bifidobacterium spp.，Clostridium clus

10、tersⅪ和Clostridium cluster(ⅪⅤ)ab明顯降低，而肝臟缺血預處理則促進其恢復。同時，基于腸道細菌的DGGE指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，肝移植早期移植物的I/R損傷造成腸道菌群多樣性指數(shù)下降、物種豐度降低、物種均衡指數(shù)下降;而肝臟缺血預處理則提高了腸道菌群的多樣性指數(shù)、物種豐度和均衡指數(shù)。DGGE聚類分析發(fā)現(xiàn)肝臟缺血預處理組和正常對照菌群結構明顯聚集在一起，相似度為77.6％。通過細菌菌群的進化樹鑒定了肝移植和肝臟缺血預處理

11、后發(fā)生顯著變化的關鍵菌群，發(fā)現(xiàn)肝臟缺血預處理后，10個關鍵菌株發(fā)生了明顯變化，大部分屬于擬桿菌門。
　　研究結論:
　　肝臟缺血預處理不僅能夠改善移植肝功能和腸道屏障功能，也能夠促進肝移植后腸道微生態(tài)的恢復，進而通過腸道微生態(tài)-肝臟軸的正反饋作用進一步促進移植肝功能的改善。
　　第二部分 移植肝急性排斥損傷的發(fā)生發(fā)展與腸道微生態(tài)變化的關系
　　研究目的:
　　急性排斥仍然是肝移植后威脅生命的并發(fā)癥;臨床上用

12、于肝移植急性排斥的有效的診斷標志物很少。本研究旨在鑒定肝移植后急性排斥的腸道微生態(tài)特征，并探討腸道微生態(tài)作為急性排斥的生物標志物的應用價值。
　　研究方法:
　　建立大鼠原位肝移植后急性排斥反應發(fā)生發(fā)展的動物模型。動態(tài)觀察急性排斥發(fā)生發(fā)展過程中移植肝病理、超微結構、移植肝功能和腸道屏障功能。動態(tài)收集大鼠回盲部內(nèi)容物進行腸道微生態(tài)分析。
　　研究結果:
　　在肝移植后急性排斥組，移植肝在移植后1天經(jīng)受了肝臟I/R損

13、傷，移植后3天開始出現(xiàn)急性排斥損傷，而移植后7天則表現(xiàn)為重度急性排斥損傷。腸道菌群定量PCR顯示，在急性排斥期間，在細菌屬的水平上，F(xiàn)aecalibacterium prausnitzii和Lactobacillus菌屬比例降低，而Clostridium bolteae比例明顯升高。重要的是，DGGE聚類分析顯示急性排斥第3天和第7天的菌群結構明顯聚類在一起，相似度為73.4％，這表明在肝移植急性排斥過程中，腸道微生態(tài)的變化早于肝臟病理

14、和肝功能的改變。同時，在急性排斥期間，腸道菌群多樣性和物種豐度均明顯降低。進化樹顯示，在急性排斥期間，大部分減少的關鍵菌屬于厚壁菌門，而增加的關鍵菌屬于擬桿菌門。在急性排斥期間，腸道微絨毛喪失，緊密連接破壞;腸道屏障功能破壞主要表現(xiàn)為糞便sIgA含量下降，血中細菌培養(yǎng)陽性率、內(nèi)毒素和TNF-α升高。
　　研究結論:
　　我們動態(tài)描述了肝移植后急性排斥反應發(fā)生發(fā)展過程中腸道微生態(tài)的變化特征，發(fā)現(xiàn)在肝移植急性排斥反應期間，腸道微