肝臟移植術(shù)后腸道微生態(tài)狀況的變化及相關(guān)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原位肝移植術(shù)是治療急、慢性重型肝炎，肝硬化肝功能失代償?shù)冉K末期肝病最有效的治療手段。隨著手術(shù)技巧的日臻精湛和免疫抑制劑的不斷發(fā)展，肝移植手術(shù)的成功率不斷提高，術(shù)后生存時(shí)間不斷延長(zhǎng)。但是，肝移植術(shù)后的感染始終是影響肝移植成功的重要因素。 當(dāng)前研究顯示肝臟和腸道微生態(tài)不僅在解剖結(jié)構(gòu)上，而且在功能上都存在著密切的關(guān)系。腸道內(nèi)寄居著種類(lèi)繁多，數(shù)量巨大的細(xì)菌，是機(jī)體內(nèi)最大的儲(chǔ)菌庫(kù)和內(nèi)毒素池，是內(nèi)源性感染和內(nèi)毒素血癥的主要來(lái)源。在正常情況下

2、，腸道正常菌群與黏膜表面的粘蛋白，sIgA，完整的腸黏膜結(jié)構(gòu)，腸壁免疫細(xì)胞共同構(gòu)成了腸道的黏膜屏障系統(tǒng)，阻止了腸道細(xì)菌，內(nèi)毒素向腸外移位。在某些病理情況下如重型肝炎，肝硬化，嚴(yán)重?zé)齻∧c移植等均可以出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡，腸壁屏障功能損傷，細(xì)菌移位以及腸源性?xún)?nèi)毒素血癥。在肝臟移植術(shù)后是否也存在微生態(tài)失衡和細(xì)菌移位等變化，以及能否通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)狀況來(lái)促進(jìn)肝移植術(shù)后功能恢復(fù)是我們所關(guān)心的問(wèn)題。本研究旨在建立穩(wěn)定的肝移植模型基礎(chǔ)上對(duì)大鼠腸道

3、微生態(tài)變化進(jìn)行深入研究。 方法大鼠原位肝移植模型采用經(jīng)典的Kamada二套袖法。所有大鼠術(shù)前和術(shù)后均不應(yīng)用抗生素，手術(shù)和取材過(guò)程均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作。實(shí)驗(yàn)共分兩部分： 第一部分：肝移植術(shù)后大鼠腸道微生態(tài)狀況變化的研究 實(shí)驗(yàn)分組：將雄性Brown-Norwy(BN)大鼠分成四組(每組18只動(dòng)物) (1)對(duì)照組 (2)假手術(shù)組(sham組) (3)同基因肝移植組(Brown-Norway大鼠→B

4、rown-Norway大鼠) (4)異基因肝移植組(Dark-Agouti大鼠→Brown-Norway大鼠) 以上所有動(dòng)物均應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢霉素A(CsA)1.0mg/kg/d皮下注射。 分別于術(shù)后D1、D7、D50天采集標(biāo)本，用于分析回盲部菌群構(gòu)成，腸道細(xì)菌移位情況，腸黏膜超微結(jié)構(gòu)，血漿內(nèi)毒素水平，肝功能情況以及肝臟和回腸末端病理學(xué)改變。 結(jié)果1.肝移植術(shù)后一天大鼠存在明顯的腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為腸桿

5、菌科細(xì)菌和腸球菌的增加(與假手術(shù)組比較，同基因移植組的P值均小與0.05，異基因移植組的P值小于0.01)，乳桿菌和雙歧桿菌的下降(與假手術(shù)組比較，同基因移植組的P值均小與0.05，異基因移植組的P值分別小于0.05和0.01)；血清ALT，AST水平和血內(nèi)毒素水平升高；腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛的損傷，細(xì)胞間緊密連接的破壞；腸黏膜充血水腫；細(xì)菌移位至肝臟，脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的陽(yáng)性率增加(與假手術(shù)組比較，同基因移植組的P值分別小于0.05，0

6、.05和0.01，異基因移植組的P值分別小于0.01，0.01和0.05)。 2.術(shù)后第七天移植組中肝功能水平和腸道菌群有了一定的恢復(fù)；其中在異基因移植組中乳桿菌和雙歧桿菌含量較低(與假手術(shù)組比較有顯著性差異，P值分別小于0.05和0.01)，細(xì)菌移位至肝臟，脾臟，腎臟和腸系膜淋巴結(jié)的比例較高(分別為83.3％，66.7％，50％和50％)，血中內(nèi)毒素水平無(wú)明顯下降(P＞0.05)。 3.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異基因大鼠肝移植術(shù)后五

7、十天已經(jīng)處于慢性排斥狀態(tài)，此時(shí)肝功能如ALT，AST，TBIL，DBIL和AKP等指標(biāo)顯著增高(與其它三組比較均有顯著性差異)；腸道黏膜充血水腫，腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌的升高(與同基因移植組比較P＜0.05)，乳桿菌的下降(與同基因移植組比較P＜0.001)；內(nèi)毒素水平無(wú)明顯下降(P＞0.05)；細(xì)菌移位陽(yáng)性率高，移位至肝臟，脾臟，腎臟和腸系膜淋巴結(jié)的分別為66.7％，66.7％，66.7％和100％。同基因移植組中大鼠肝功能

8、情況，腸道菌群構(gòu)成以及內(nèi)毒素水平已經(jīng)基本恢復(fù)正常。 第二部分：微生態(tài)制劑對(duì)異基因大鼠肝移植術(shù)后腸道菌群和細(xì)菌移位的影響實(shí)驗(yàn)分組：將雄性Brown-Norway(BN)大鼠和Dark-Agouti(DA)配對(duì)分成三組：(每組12對(duì)) (1)對(duì)照組：異基因肝移植組(Dark-Agouti大鼠→Brown-Norway大鼠)+CsA+3ml滅菌水灌胃 (2)乳桿菌組：異基因肝移植組(Dark-Agouti大鼠→Brow

9、n-Norway大鼠)+CsA+3ml乳桿菌灌胃 (3)乳果糖組：異基因肝移植組(Dark-Agouti大鼠→Brown-Norway大鼠)+CsA+3ml乳果糖灌胃 各組于術(shù)前7天開(kāi)始灌胃：對(duì)照組給予3ml滅菌水，乳桿菌治療組則予羅伊氏乳桿菌(LactobacillusreuteriATCC55730，含量為4×109)，乳果糖組則予以乳果糖1g灌胃。以上所有動(dòng)物從手術(shù)結(jié)束當(dāng)天開(kāi)始均應(yīng)用免疫抑制劑環(huán)孢霉素A(CsA)1

10、.0mg/kg/d直至取材。(注：手術(shù)的當(dāng)天不給予灌胃，術(shù)后第二天開(kāi)始恢復(fù)灌胃，直至第七天處死。) 每組在術(shù)后1天和7天處死動(dòng)物采集標(biāo)本(每組6只動(dòng)物)，用于分析回盲部菌群構(gòu)成，腸道細(xì)菌移位情況，腸黏膜超微結(jié)構(gòu)，血漿內(nèi)毒素水平，肝功能情況以及肝臟和回腸末端病理學(xué)改變。 結(jié)果1.術(shù)前給予乳桿菌和乳果糖制劑均可降低肝移植術(shù)后第一天血內(nèi)毒素水平(與對(duì)照組比較，P＜0.01)，降低細(xì)菌移位至肝臟，脾臟和腎臟的比例(與對(duì)照組比較，

11、乳桿菌組的P值分別小于0.01，0.01和0.05，乳果糖組的P值分別小于0.05，0.01和0.05)；其中乳桿菌組腸道菌群結(jié)構(gòu)改善，表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌含量下降(P值均小于0.01)，乳桿菌含量上升(P＜0.05)；而乳果糖組腸道菌群表現(xiàn)為乳桿菌和雙歧桿菌明顯上升(P值分別小于0.01和0.001)，腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌沒(méi)有變化。 2.手術(shù)后七天觀察發(fā)現(xiàn)，乳桿菌或乳果糖均可降低血內(nèi)毒素水平(與對(duì)照組比較，P分別小于0.

12、05和0.01)，降低細(xì)菌移位至肝臟，脾臟和腎臟的比例(P值均小于0.05)；其中乳桿菌組中腸道內(nèi)乳桿菌和類(lèi)桿菌的含量增加(P＜0.05)，血清AST，TBIL水平降低(P＜0.05)；乳果糖組腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量增加(P＜0.01)，腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌減少(P＜0.001)，血清ALT，AST以及DBiL水平明顯下降(P值分別小于0.01，0.05和0.05)。 結(jié)論：本研究結(jié)果提示，肝移植術(shù)后存在一定程度的腸道微生態(tài)的紊亂和