決定Ago2在P-Body定位的關(guān)鍵氨基酸.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。Ago(Argonaute)蛋白家族是含有PIWI和PAZ基本結(jié)構(gòu)域的一類成員數(shù)目較多的蛋白家族，近年來研究發(fā)現(xiàn)Ago蛋白家族的很多成員在RNA干擾現(xiàn)象中有重要的作用。在果蠅和人體細(xì)胞中，Ago2(Argonaute2)為RNA干擾機(jī)器RSIC(RNA-i

2、nduced silencing complex)的核心部分，在RNA干擾中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。 P-Body(Cytoplasmic Processing Body)最初在酵母中發(fā)現(xiàn)。在它細(xì)胞中與RNA降解有關(guān)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多和RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA降解以及相關(guān)的蛋白在P-Body內(nèi)聚集。現(xiàn)在，已有充分證據(jù)證明RNAi體系和P-body的形成有關(guān)聯(lián)。例如RNA干擾機(jī)器RSIC上的核心蛋白Ago2也在P-body內(nèi)聚集；Ago

3、2與mRNA的結(jié)合會(huì)影響P-Body在細(xì)胞的存在狀態(tài)等等。因?yàn)锳go2及P-Body和RNAi現(xiàn)象緊密聯(lián)系，所以研究Ago2在P-Body內(nèi)的定位對(duì)于了解P-Body和RNAi的關(guān)系有重要的意義。 本論文通過構(gòu)建一系列的Ago2突變子使用熒光免疫染色方法來尋找影響Ago2定位于P-Body的關(guān)鍵氨基酸。我們隨機(jī)得到一個(gè)有六個(gè)氨基酸發(fā)生突變的Ago2突變子，為Ago2-G32W-F128L-R196Q-P458S-T741A-S

4、752G，它完全不在P-Body內(nèi)定位。這六個(gè)氨基酸單點(diǎn)突變子都不能使Ago2完全定位于P-Body之外。相對(duì)于其他的五個(gè)氨基酸我們發(fā)現(xiàn)Ago2上第752位的Ser對(duì)于Ago2在P-Body的定位尤為重要。當(dāng)Ago2第752位Ser突變?yōu)镚ly時(shí)，Ago2在P-body的定位率大大降低。但是單獨(dú)的第752位Ser突變還不足以使Ago2完全不定位于P-Body之外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它還需要第32位Gly、128位Phe、458位Pro突變的協(xié)助，