調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方血壓峰值前給藥對SHR腎保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　本實驗以調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方為干預(yù)因素，以SHR大鼠血壓峰值前兩小時為復(fù)方給藥時間（即:19:00和00:00），綜合采用多種檢測方法（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定法、電鏡光鏡及免疫組化等），深入探討觀察調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的血壓、腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)和腎Ⅰ、Ⅳ型膠原含量、腎Ang‖含量、腎TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、CTGF、ECM的橋連接蛋白(FN)

2、基因表達(dá)以及TGF-β1、CTGF、FN1蛋白表達(dá)影響。從整體水平、組織形態(tài)學(xué)、基因及蛋白等各方面，觀察調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方血壓峰值前給藥對SHR的降血壓及腎臟保護(hù)的作用，探討其作用機制，從時間生物學(xué)上為高血壓病的臨床治療而提供實驗的依據(jù)，并為中醫(yī)藥對高血壓病的治療和腎臟保護(hù)作用的研究和開發(fā)提供思路和理論依據(jù)。
　　內(nèi)容與方法:
　　研究內(nèi)容:
　　1.中藥復(fù)方峰值前給藥對SHR早期腎損害的影響;
　　2.中藥復(fù)方

3、峰值前給藥對SHR心腎組織形態(tài)學(xué)的影響;
　　3.中藥復(fù)方峰值前給藥對SHR的TGF-β1-CTGF-FN1信號通路調(diào)節(jié)影響;
　　4.中藥復(fù)方峰值前給藥對SHR的TGF-β1-Smads信號通路調(diào)節(jié)的影響。
　　實驗方法:
　　1.中藥:調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方（成人一日量）
　　熟地25g、龜板30g（先煎）、丹參15g、瓜萎12g、田七5g、鉤藤12g（后下）
　　以上藥材均購自廣州市藥材公司中藥飲片

4、廠生產(chǎn)，編號:13093120等，并經(jīng)過鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)煎藥（濃度含生藥200mg· mL-1）。藥液冷卻后，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>　　氯沙坦商品名:科亞素，批號:130101，100mg/片，由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)。
　　2.實驗動物及分組
　　實驗采用11周齡SPF級自發(fā)性高血壓大鼠（即SHR）模型30只及SD大鼠10只，體重220±20g。分別購于北京維通利華生物科技有限公司以及廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗

5、動物中心。
　　人鼠于實驗前常規(guī)觀察1周，然后進(jìn)行分組實驗。
　　SHR大鼠30只隨機分為3組:中藥復(fù)方組、模型組、西藥組（氯沙坦組），每組各10只;SD大鼠10只作為正常對照組。
　　全程給予高蛋白固體顆粒飼料喂養(yǎng)。
　　3.給藥及喂養(yǎng)方式:中藥復(fù)方組每天按照最佳給藥時間（即:19:00和00:00）灌胃兩次，按照臨床等效劑量，為4g·kg-1;西藥組按照常規(guī)給藥早上灌胃一次，劑量為0.03g·kg-1，模型組

6、和對照組給予0.144 g·kg-1的生理鹽水，共12周。
　　4.收縮壓測量:于給藥前和給藥后2、4、6、8、10、12周用無創(chuàng)血壓測定儀測定血壓，記錄各組大鼠收縮壓。
　　5.Elisa法檢測大鼠尿微量白蛋白(mALb)、尿β2微球蛋白(β2-MG)水平。
　　6.全自動生物化學(xué)分析儀檢測每組大鼠血清的肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)含量。
　　7.電鏡和光鏡觀察每組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的變化。
　　8.免疫

7、組化法檢測腎組織的Ang‖、CollagenⅠ、CollagenⅣ、Smad2，Smad3和Smad7原積分光密度值的變化。
　　9.RT-PCR法檢測腎組織中TGF-β1，CTGF，F(xiàn)N，Smad2，Smad3和Smad7的mRNA表達(dá)。
　　10.Western blot法檢測腎組織中TGF-β1，CTGF和FN蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.用藥前后血壓的變化
　　實驗用藥前與用藥后2周、4周、6周

8、、8周、10周和12周分別采用智能無創(chuàng)血壓計，監(jiān)測每組大鼠尾動脈的收縮壓變化。結(jié)果顯示，用藥前SHR各組大鼠的血壓均高于SD組，SD組與其他各組比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而其余各組間比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);給藥2周后:顯示西藥組的收縮壓明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而中藥復(fù)方組的大鼠收縮壓也有一定程度的下降，但與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;給藥4周后:西藥組的收縮壓持續(xù)下降，西

9、藥組與SHR組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，中藥復(fù)方組開始顯示降血壓的效果，與SHR組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)，與西藥組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;給藥后6周10周:西藥組和中藥復(fù)方組持續(xù)降壓，中藥組與模型組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，與西藥組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，西藥組和模型組相比有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);給藥后12周:中藥復(fù)方組和西藥組一直平穩(wěn)降壓，中藥復(fù)方組效果逐漸接近西藥組

10、，與西藥組沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.各組大鼠血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)含量
　　與正常組比較，模型組肌酐(SCr)含量明顯上升(P＜0.01);與模型組比較，復(fù)方組肌酐(SCr)含量明顯下降(P＜0.01)。與正常組比較，模型組、復(fù)方組和西藥組的尿素氮(BUN)含量明顯上升(P＜0.01)，模型組、復(fù)方組和西藥組并無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.各組大鼠尿微量白蛋白(mALb)、尿β2

11、微球蛋白(β2-MG)的含量
　　與正常組比較，模型組mALb蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01);與模型組比較，復(fù)方組mALb蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，而西藥組沒有明顯調(diào)節(jié)作用。與正常組比較，模型組和西藥組β2-MG蛋白表達(dá)無明顯變化，復(fù)方組β2-MG蛋白明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　4.腎臟組織光鏡下形態(tài)學(xué)比較
　　復(fù)方組:大鼠腎小球的系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)均未見明顯增生，腎小管的上皮細(xì)胞完好，間質(zhì)未見沉著的纖維

12、結(jié)締組織和炎細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)未見管形;西藥組:腎小球有輕度增生的系膜細(xì)胞和系膜，管腔內(nèi)未見管形，腎小管上皮細(xì)胞完好;正常對照組:大鼠腎小球的系膜細(xì)胞未見明顯的增生，管腔內(nèi)未見管形，腎小管上皮細(xì)胞完好，系膜基質(zhì)未明顯增多，間質(zhì)未見沉著的纖維結(jié)締組織和炎細(xì)胞浸潤;模型組:大鼠腎小球明顯萎縮，壞死，管腔輕微變窄。
　　5.腎臟組織電鏡下形態(tài)學(xué)比較
　　復(fù)方組:腎小球系膜細(xì)胞核系膜基質(zhì)未見明顯增生，上皮細(xì)胞足突排列整齊;西藥組:腎小

13、球系膜細(xì)胞伸出的足突相互融合，形成片狀，輕度增粗，相鄰的基膜增厚;模型組:腎小球系膜細(xì)胞核大，胞漿少，周圍基膜明顯增厚，膠原纖維增生明顯;正常對照組:腎小球系膜細(xì)胞、基質(zhì)未見增生，基膜厚度均勻，上皮細(xì)胞足突排列整齊。
　　6.免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠CollagenⅠ型和Ⅳ型蛋白表達(dá)的分析結(jié)果與正常對照組比較，模型組CollagenⅠ型和Ⅳ型的蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01);與模型組比較，復(fù)方組和西藥組CollagenⅠ型

14、和Ⅳ型的蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01)，復(fù)方組和西藥組CollagenⅠ型和Ⅳ型蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），復(fù)方組CollagenⅠ型和空白組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　7.免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠腎組織Ang‖蛋白表達(dá)的分析結(jié)果
　　與正常對照組相比，模型組的腎臟組織Ang‖蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01）;與模型組比較，復(fù)方組和西藥組腎組織Ang‖的蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01)，兩組

15、問腎組織的Ang‖蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）;其中，復(fù)方組和西藥組的腎組織Ang‖蛋白表達(dá)與空白組沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　8.免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠腎組織Smad2，Smad3和Smad7蛋白表達(dá)的分析結(jié)果
　　與正常對照組比較，模型組Smad2和Smad3的蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01)，Smad7的蛋白表達(dá)相應(yīng)下調(diào)（P＜0.01）;與模型組比較，復(fù)方組和西藥組Smad2和Smad3的蛋白

16、表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01），Smad7表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01)，復(fù)方組和西藥組的Smad2、Smad3和Smad7蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，其中，復(fù)方組的Smad7蛋白表達(dá)與正常對照組沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　9.腎臟組織中Smad2，Smad3和Smad7的mRNA水平表達(dá)
　　與正常對照組比較，模型組Smad2和Smad3的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01)，Smad7的mRNA表達(dá)

17、相應(yīng)下調(diào)（P＜0.01);與模型組比較，復(fù)方組和西藥組Smad2和Smad3 mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01），Smad7 mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05)，復(fù)方組和西藥組Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　10.腎臟組織中TGF-β1，CTGF和FN的mRNA水平的表達(dá)
　　與正常對照組比較，模型組TGF-β1，CTGF和FN的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.

18、01）;與模型組比較，復(fù)方組TGF-β1的mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01)，且優(yōu)于西藥組（P＜0.05）;復(fù)方組CTGF和FN的mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01），和西藥組沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　11.腎組織中TGF-β1，CTGF、FN的western blot蛋白水平表達(dá)
　　與正常組比較，模型組CTGF、FN蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.01)。與模型組比較，復(fù)方組TGF-β1、CTGF、FN

19、蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01）;西藥組TGF-β1、FN蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.01或0.05)。與西藥組比較，復(fù)方組CTGF和FN的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方血壓峰值前給藥可以降低SHR的血壓。
　　2.調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方血壓峰值前給藥可以降低SHR血清肌酐(SCr)的含量，降低尿微量白蛋白(mALb)、尿β2微球蛋白(β2-MG)的含量，改善腎損害的病理狀態(tài)，

20、具有腎保護(hù)作用。
　　3.調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方對腎臟的保護(hù)作用機制，可能是通過降低Ang‖蛋白水平，上調(diào)Smad7，下調(diào)Smad2和Smad3的mRNA表達(dá)，從而降低腎組織中的中Ⅰ型膠原蛋白和Ⅳ型膠原蛋白含量，減少異常聚集的ECM，增加ECM的降解，延緩腎小管和間質(zhì)的纖維化。
　　4.調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方腎保護(hù)的作用靶點，可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1-Smads和TGF-β1-CTGF-FN的傳導(dǎo)通路，抑制病理條件下腎小管的上皮細(xì)