復(fù)方黃甘對(duì)5-6腎切除大鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究擬通過(guò)建立HPLC指紋圖譜，并利用HPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)復(fù)方黃甘的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析，在初步闡明復(fù)方中的物質(zhì)基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步采用5/6腎切除法構(gòu)建CKD大鼠模型，確切復(fù)方黃甘的藥效，并從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的干預(yù)作用，初步探討其抗腎臟纖維化的可能作用機(jī)制，為其臨床治療CKD提供新的思路和可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　(1)通過(guò)醇提和水提

2、醇沉合并工藝，制備復(fù)方黃甘提取物。
　　(2)利用5/6腎切除法構(gòu)建CKD大鼠模型，并于給藥前（術(shù)后2周）檢測(cè)5/6腎切除模型組與假手術(shù)組的血清Scr、BUN水平，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒Α?br>　　(3)取藥效實(shí)驗(yàn)部分大鼠腎組織，分別提取組織中RNA與總蛋白。
　　(4)HK-2細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)模型的構(gòu)建
　　結(jié)果：
　　1.復(fù)方黃甘物質(zhì)基礎(chǔ)研究
　　(1)經(jīng)提取干燥后復(fù)方黃甘1g浸膏相當(dāng)于4.6g

3、原藥材。采用PDA檢測(cè)器在200～400nm全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃甘在254nm處有最大吸收，特征峰明顯且峰型與分離度都較好。采用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”，根據(jù)10批次樣本的HPLC圖譜生成對(duì)照指紋圖譜，共標(biāo)示出21個(gè)共有峰，共有峰的面積占總面積93％以上。10批次復(fù)方黃甘具有較好的一致性，提取方法穩(wěn)定，利用紫外HPLC指紋圖譜能較好的控制復(fù)方黃甘整體質(zhì)量。
　　(2)采用HPLC-QTOF/

4、MS檢測(cè)分析，從質(zhì)譜總離子流圖中通過(guò)自動(dòng)尋找和手動(dòng)匹配的方法，共得到38種響應(yīng)化合物，其中以正離子模式11個(gè)化學(xué)成分，負(fù)離子模式27個(gè)化學(xué)成分。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間對(duì)比分析及質(zhì)譜分子離子峰與碎片峰對(duì)比分析確定，主要的8種化合物分別為甘草苷、射干苷、木樨草素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。
　　(3)用HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)得復(fù)方黃甘中主要8各成分的含量分別為:甘草苷(0.167％)、射干苷(1.98％)、木樨

5、草素(1.03％)、蘆薈大黃素(3.78％)、大黃酸(3.13％)、大黃素(1.54％)、大黃酚(2.72％)、大黃素甲醚(1.55％)。
　　2.復(fù)方黃甘藥效學(xué)研究
　　(1)造模2周后，腎切除大鼠Scr與BUN水平都顯著高于假手術(shù)組(P＜0.001)，提示造模成功。給藥期間，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重?zé)o顯著性差異，且呈逐漸上升趨勢(shì)。
　　(2)血清生化指標(biāo):各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進(jìn)行組間的多重比較。

6、統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:給藥12周后，模型組大鼠腎臟指數(shù)（RI）、Scr、BUN、UPr都顯著高于假手術(shù)組和本底對(duì)照組（P＜0.01），肌酐清除率(Ccr)顯著低于假手術(shù)組和本底對(duì)照組（P＜0.05）。假手術(shù)組和本底對(duì)照組之間各項(xiàng)生化指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組大鼠間RI、Scr、BUN、Ccr、UPr水平均有顯著性差異（F=4.044，P=0.001;F=58.951，P＜0.001;F=114.147，P＜0.001;F=4.

7、113，P=0.001;F=6.108，P＜0.001）:各給藥組RI均顯著低于模型組(P＜0.001)，復(fù)方黃甘中、高劑量組BUN均顯著低于模型組（P＜0.05），且其三個(gè)劑量組均顯著低于氯沙坦組（P＜0.01），中、高劑量組Scr顯著低于模型組(P＜0.05)，復(fù)方黃甘低高劑量組Ccr水平均顯著高于模型組與氯沙坦組(P＜0.05)，而復(fù)方黃甘低、中、高劑量組UPr顯著低于模型組(P＜0.05)，但低、高劑量組高于氯沙坦組(P＜0.0

8、1)。復(fù)方黃甘三個(gè)劑量組RI、Scr、BUN、Ccr、UPr水平與尿毒清組均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　(3)各個(gè)給藥組CHOL與LDL均顯著低于模型組（P＜0.05），但除了氯沙坦組的CHOL水平（P=0.971）。復(fù)方黃甘低、中、高劑量組均能降低腎組織中MDA水平、升高SOD、T-AOC、CAT以及GSH-PX，與模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。血清AOPP水平復(fù)方黃甘低、中、高劑量組都顯著低于模型組(P＜0.0

9、01)，且中、高劑量組顯著低于尿毒清組(P＜0.001)與氯沙坦組(P＜0.01)。
　　(4)HE與Masson染色結(jié)果顯示:術(shù)后15周，假手術(shù)組與本底對(duì)照組大鼠腎組織未見明顯病理改變。復(fù)方黃甘組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、小管萎縮、腎小球硬化與間質(zhì)纖維化等癥狀都有明顯的不同程度的減輕。
　　3.復(fù)方黃甘對(duì)CKD大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響
　　(1)RT-PCR結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織Wnt1、β-ca

10、tenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fn1 mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.784，P=0.004;F=9.140，P＜0.001; F=9.781，P＜0.001; F=7.004，P＜0.001; F=8.059，P＜0.001;F=2.858，P=0.021）。復(fù)方黃甘低、中、高劑量組均顯著抑制Wnt1、β-catenin、Tcf4以及Fn1 mRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，與假手

11、術(shù)組和本底對(duì)照比較，復(fù)方黃甘三個(gè)劑量組均能上調(diào)Gsk-3β與Dkk1 mRNA水平(P＜0.01，P＜0.05)）。
　　(2)Westem blot蛋白表達(dá)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相吻合:與模型組比較，復(fù)方黃甘低、中、高劑量組都顯著抑制Wnt1（P＜0.001）、β-catenin(P＜0.05)、Tcf4（P＜0.05）以及Fn1(P＜0.001)蛋白的表達(dá)，且假手術(shù)組與本底對(duì)照組間Wnt1、β-catenin、Tcf4、Dkk

12、1、Fn1蛋白以及Gsk-3β磷酸化水平均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　(3)免疫組化結(jié)果顯示:Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1、以及Fn1蛋白在假手術(shù)組與模型組均有表達(dá)，但假手術(shù)組表達(dá)范圍小、色澤淺，表達(dá)量相對(duì)較弱。Wnt1、Dkk1與Tcf4三種蛋白的表達(dá)部位相似，主要集中在腎小管上皮細(xì)胞以及腎小球系膜細(xì)胞，且在腎小球中表達(dá)更強(qiáng)。β-catenin與Gsk-3β則主要表達(dá)在腎小球系膜細(xì)胞與遠(yuǎn)

13、曲小管上皮細(xì)胞中。而Fn1主要在腎小球系膜細(xì)胞、基底膜以及腎小管間質(zhì)中表達(dá)，這正是構(gòu)成小管間質(zhì)纖維化的主要原因。而半定量的結(jié)果與RT-PCR和westemblot結(jié)果大體一致。
　　4.復(fù)方黃甘通過(guò)Wnt通路對(duì)HK-2細(xì)胞EMT的干預(yù)作用
　　(1)復(fù)方黃甘對(duì)HK-2細(xì)胞作用48h后的最大安全濃度為200ug/ml。高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞12、24、48h后，EMT標(biāo)志性蛋白α-SMA與Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表

14、達(dá)逐漸升高，而甘露醇(HM)組與正常對(duì)照組(NC)在處理時(shí)間內(nèi)，都無(wú)明顯表達(dá)。說(shuō)明高糖能誘導(dǎo)HK-2發(fā)生EMT，且能激活Wnt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，高糖高滲透壓對(duì)目的蛋白的表達(dá)無(wú)影響。
　　(2)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞12、24、48h，并同時(shí)給予藥物處理，在12h前Wnt1、β-catenin、Tcf4、α-SMA、Fn1 mRNA的表達(dá)都較弱，藥物抑制作用不明顯。在24～48h間，Wnt通路激活達(dá)到高峰。

15、統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞48h后，高糖模型組(HG) Wnt1 mRNA表達(dá)水平較正常組顯著升高（P＜0.001），ICG-001陽(yáng)性對(duì)照組能顯著抑制其表達(dá)(vs.HGP＜0.001)，復(fù)方黃甘高、低劑量組亦有此抑制表達(dá)的作用（P=0.01，P=0.02），且與ICG-001組無(wú)顯著性差異（P=0.276，P=0.122），但復(fù)方黃甘高、低劑量組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.601）。而各個(gè)給藥組對(duì)β-catenin、Tcf4、α-

16、SMA、Fn1 mRNA的表達(dá)，均表現(xiàn)出了與Wnt1同樣的抑制趨勢(shì)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(3)Western blot結(jié)果顯示:高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞48h后，Wnt通路相關(guān)蛋白顯著上調(diào)，α-SMA與Fn1分泌增多。ICG-001陽(yáng)性對(duì)照與復(fù)方黃甘高、低劑量組均能抑制該通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低HK-2細(xì)胞在EMT過(guò)程中分泌的α-SMA與Fn1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中也同樣證明，復(fù)方黃甘高、低

17、劑量組均能降低α-SMA與β-catenin的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　(1)復(fù)方黃甘提取物的制備方法穩(wěn)定可靠，不同批次復(fù)方黃甘提取物具有較好的一致性，通過(guò)建立HPLC指紋圖譜能較好的控制復(fù)方黃甘整體質(zhì)量。
　　(2)利用Q-TOF/MS與HPLC方法，解析并測(cè)定復(fù)方中主要成分及其含量，基本明確了復(fù)方黃甘作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，提高了復(fù)方黃甘質(zhì)量控制水平與標(biāo)準(zhǔn)。
　　(3)復(fù)方黃甘能有效保護(hù)5/6腎切除大鼠殘余腎功能，顯著