鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠血管重塑的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1．通過(guò)應(yīng)用鉤藤中藥復(fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠模型的干預(yù)，研究鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠血壓和血漿內(nèi)皮素-1（ET-1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、一氧化氮（NO）的影響，以及對(duì)動(dòng)脈組織一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)的影響，探討鉤藤?gòu)?fù)方的降血壓機(jī)制。
　　 2．通過(guò)研究鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠主動(dòng)脈壁形態(tài)學(xué)及VSMC超微結(jié)構(gòu)的改變和動(dòng)脈組織中Ⅰ型膠原（CICF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、骨橋蛋白（OPN）

2、含量以及bFGF、OPN mRNA表達(dá)的影響，探討鉤藤?gòu)?fù)方抑制高血壓血管重塑的機(jī)制。
　　 3．通過(guò)對(duì)高血壓的致病機(jī)理的研究，結(jié)合中醫(yī)藥學(xué)相關(guān)理論，在細(xì)胞、分子、基因水平上揭示鉤藤?gòu)?fù)方中藥對(duì)緩解高血壓癥狀、改善和抑制高血壓的血管重塑及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能方面的生理學(xué)作用機(jī)制，為篩選最佳臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1．實(shí)驗(yàn)藥品
　　 （1）鉤藤、天麻、黃芪、丹參、決明子、白芍、牛膝、

3、桑葉。生藥材經(jīng)過(guò)再次干燥，按處方比例混合均勻，于常溫下加入蒸餾水浸泡1小時(shí)；文火煎煮三次，每次煎煮時(shí)間為1小時(shí)；將過(guò)濾后的濾出液混合并濃縮，制成每毫升含生藥2克的濃縮液，-4℃冰箱保存。
　　 （2）牛黃降壓丸：1.6克/丸。以蒸餾水配制成0.2克/毫升的藥液，供大鼠灌胃使用。
　　 （3）卡托普利（CAP）：25毫克/片。以蒸餾水配制成2.5毫克/毫升的藥液，供大鼠灌胃使用。
　　 2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本實(shí)驗(yàn)采用Go

4、ldblatt經(jīng)典腎性高血壓大鼠模型并加以改進(jìn)，建立“兩腎一夾”腎性高血壓大鼠模型（RHR）。
　　 3．分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型分為6組，每組10只：空白對(duì)照組、模型組、鉤藤高劑量組、鉤藤低劑量組、中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組。
　　 4．方法:鉤藤高劑量組給與20g生藥/kg/d，低劑量組6.6g生藥/kg/d，西藥對(duì)照組7.5 mg/Kg/d，中藥對(duì)照組0．96g/kg/d，空白對(duì)照組及模型組均給予1ml/100g的蒸餾水灌胃

5、。每日上午給藥一次，持續(xù)12周。最后一次給藥后24小時(shí)禁食，不禁水。用10％水合氯醛，按0.4ml/100g的劑量腹腔注射麻醉動(dòng)物后取材。
　　 5．研究?jī)?nèi)容
　　 （1）腎性高血壓模型的建立與評(píng)價(jià)；（2）鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠血壓的影響；（3）鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠血漿ET-1、NO、AngⅡ水平的影響；（4）主動(dòng)脈壁病理學(xué)觀察，形態(tài)學(xué)指標(biāo)：主動(dòng)脈中膜厚度（MT）、中膜膠原面積檢測(cè)及VSMC超微結(jié)構(gòu)觀察；（6）應(yīng)用

6、酶聯(lián)免疫法（Elisa）測(cè)定腎性高血壓大鼠動(dòng)脈組織中CICF、eNOS、bFGF、OPN含量；（7） RT-PCR法檢測(cè)腎性高血壓大鼠主動(dòng)脈壁bFGF、OPN mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．腎性高血壓模型的建立與評(píng)價(jià):與空白對(duì)照組比較，手術(shù)組即左側(cè)腎動(dòng)脈部分狹窄后，“兩腎一夾”高血壓大鼠模型在3天內(nèi)收縮壓開(kāi)始出現(xiàn)升高，7天后血壓急劇上升，14天高血壓已初步形成，28天時(shí)動(dòng)脈收縮壓由術(shù)前的（101．80±4.18

7、） mmHg上升到（152．32±4.53） mmHg，具有顯著性差異。
　　 2．鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)RHR大鼠血壓及血中AngⅡ、ET-1、NO含量、動(dòng)脈組織eNOS活性的影響
　　 （1）鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性RH大鼠血壓的影響:經(jīng)過(guò)連續(xù)藥物干預(yù)，治療后第3周開(kāi)始，西藥對(duì)照組首先出現(xiàn)血壓降低，與模型組和治療前相比有顯著性差異，其后呈逐漸顯著下降趨勢(shì)。其他治療組從第6周開(kāi)始出現(xiàn)持續(xù)性血壓降低，其中鉤藤高劑量組與治療前和模型組比較有顯著

8、差異，治療9周后鉤藤?gòu)?fù)方低劑量組、中藥對(duì)照組出現(xiàn)顯著血壓下降。
　　 （2）血漿中AngⅡ含量的比較:與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠血漿AngⅡ濃度明顯升高，具有顯著差異。除西藥對(duì)照組外，各給藥組大鼠血漿AngⅡ濃度均有顯著升高。各給藥組大鼠除鉤藤低劑量組外血漿AngⅡ濃度均低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。西藥對(duì)照組血漿AngⅡ濃度均高于其它給藥組，且顯著高于低劑量組。
　　 （3）血漿中ET-1含量的比較:與空白對(duì)照組相比

9、，模型組和西藥對(duì)照組大鼠血漿ET-1濃度明顯增加。除西藥對(duì)照組外，各治療組大鼠血漿ET-1濃度較模型組均有顯著下降，其中高劑量組下降最為顯著，其次為低劑量組、中藥對(duì)照組。高劑量組與西藥對(duì)照組相比，血漿ET-1濃度也明顯降低。
　　 （4）血清NO含量的比較:與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清NO含量明顯低于空白對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組大鼠血漿NO含量與模型組比較均有升高，其中高劑量組升高最為顯著，其次為低劑量組、中藥

10、對(duì)照組，西藥對(duì)照組與模型組比較雖有升高但無(wú)顯著性差異。高劑量組與西藥對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 （5）動(dòng)脈組織中eNOS活性的比較:與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈eNOS活性明顯低于空白對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組大鼠eNOS活性與模型組比較均有顯著升高。西藥對(duì)照組與模型組比較雖有升高但無(wú)顯著性差異。鉤藤高劑量組與西藥對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3．鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠動(dòng)脈壁形態(tài)

11、學(xué)、超微結(jié)構(gòu)及CICF的影響
　　 （1）光鏡下主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察:HE染色切片顯示：模型組與空白對(duì)照組相比血管中膜厚度（MT）顯著升高。與模型組相比，各給藥組主動(dòng)脈中膜厚度均有所降低，高劑量組和西藥對(duì)照組中膜厚度降低最顯著。但各治療組間差異無(wú)顯著性。
　　 （2）光鏡下Masson染色觀察:染色結(jié)果：大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）經(jīng)Masson染色為淡粉色，細(xì)胞間質(zhì)成分染色紋理界限清晰的淺綠色。分組光鏡結(jié)果顯示：空白對(duì)照

12、組大鼠管壁間質(zhì)成分較少呈均質(zhì)狀，血管中膜膠原纖維排列整齊連續(xù)、層次清晰。模型組大鼠與空白對(duì)照組比較可見(jiàn)有明顯的間質(zhì)成分增多，血管壁平滑肌層明顯增生紊亂，間質(zhì)增多，膠原纖維排列紊亂，表現(xiàn)為間隙加大、過(guò)度迂曲、層次混亂、局部出現(xiàn)斷裂。與模型組相比，各給藥組動(dòng)脈管壁間質(zhì)成分則有不同程度下降，中膜膠原纖維排列亦較規(guī)整。
　　 （3）主動(dòng)脈中膜膠原面積百分比（VFC）的比較:模型組大鼠與空白對(duì)照組比較，主動(dòng)脈壁中膜膠原面積百分比顯著升高。

13、與模型組相比，各給藥組主動(dòng)脈中膜膠原面積百分比顯著減少,其中高劑量組和低劑量組減少最為顯著。
　　 （4）主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察:透射電鏡觀察顯示：空白對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核的形態(tài)較規(guī)則，線粒體數(shù)量較少，無(wú)變形，嵴規(guī)整。模型組大鼠主動(dòng)脈VSMC異常增大，局部線粒體數(shù)量明顯增多、個(gè)體腫大、基質(zhì)密度下降，嵴數(shù)量減少、移位、局部出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核變形明顯，呈不規(guī)則狀，密度不均勻，染色質(zhì)靠近核內(nèi)膜呈

14、不規(guī)則分布，局部核質(zhì)固縮。其他治療組大鼠主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞形態(tài)均有不同程度好轉(zhuǎn)，與模型組相比，線粒體數(shù)量明顯減少，形態(tài)也較規(guī)則，細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布。
　　 （5）主動(dòng)脈組織中C1CF含量的比較:與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠血管壁C1CF含量明顯升高。與模型組大鼠相比，各給藥組C1CF含量均顯著下降，其中高劑量組下降最為顯著，依次為低劑量組、中藥對(duì)照組和西藥對(duì)照組。各給藥間無(wú)顯著性差異。
　　 4．鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)RHR

15、大鼠動(dòng)脈組織中bFGF、OPN含量及mRNA表達(dá)的影響
　　 （1）主動(dòng)脈組織中bFGF含量的比較:與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠血管壁bFGF含量明顯升高；實(shí)驗(yàn)后與模型組大鼠相比，各給藥組bFGF含量均有顯著下降；高劑量組下降最為顯著，接近空白對(duì)照組，但仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；中藥對(duì)照組與高劑量組比較亦有顯著差異。
　　 （2）主動(dòng)脈組織中OPN含量的比較:與空白對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠血管壁OPN含量明顯升高。與模型組大

16、鼠相比，實(shí)驗(yàn)各組OPN含量均有顯著下降，高劑量組OPN蛋白含量下降最為顯著；中藥對(duì)照組及西藥對(duì)照組與高劑量組和低劑量組比較均有顯著差異。
　　 （3）動(dòng)脈組織中bFGF mRNA表達(dá)的比較:模型組大鼠血管壁bFGF mRNA表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組。高、低劑量組bFGF mRNA表達(dá)與模型組比較顯著下降；中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組與模型組相比也有顯著性差異；中藥對(duì)照組及西藥對(duì)照組mRNA表達(dá)與高劑量組比較有顯著差異。
　　 （

17、4）動(dòng)脈組織中OPN mRNA表達(dá)的比較:模型組大鼠血管壁OPNmRNA表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組。高、低劑量組OPN mRNA表達(dá)與模型組比較顯著下降，中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組與模型組相比也有顯著性差異；中藥對(duì)照組及西藥對(duì)照組mRNA表達(dá)與高劑量組比較有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1．鉤藤?gòu)?fù)方對(duì)腎性高血壓大鼠模型具有顯著的降壓療效，其降壓機(jī)制可能是通過(guò)降低腎性高血壓大鼠血漿AngⅡ、ET-1水平，升高NO的水平及血管內(nèi)皮

18、eNOS的表達(dá)，從而改善腎性高血壓大鼠的病理體質(zhì)而發(fā)揮藥效，亦說(shuō)明鉤藤?gòu)?fù)方中藥組方的合理性。
　　 2．鉤藤?gòu)?fù)方中藥能夠改善腎性高血壓大鼠主動(dòng)脈中膜VSMC增殖、遷移改變。其機(jī)制與鉤藤?gòu)?fù)方中藥抑制bFGF和OPN對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用有關(guān)。
　　 3．鉤藤?gòu)?fù)方中藥能明顯改善腎性高血壓大鼠主動(dòng)脈壁形態(tài)學(xué)指標(biāo)，降低主動(dòng)脈中膜膠原含量，對(duì)腎性高血壓大鼠主動(dòng)脈血管重塑進(jìn)程有明顯的抑制作用，其機(jī)制與鉤藤?gòu)?fù)方中藥抑制主動(dòng)脈壁b