CDC聯(lián)合心室肌細(xì)胞外基質(zhì)治療大鼠急性心梗效果的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　心肌梗塞引起心肌細(xì)胞壞死，纖維組織增生，瘢痕形成，心臟擴(kuò)大，收縮力減低，最終導(dǎo)致心衰。雖然近年來心梗的藥物治療（抗血小板藥物，ACEI類藥物，調(diào)脂類藥物）及侵入性治療（PCI及CABG）取得了顯著進(jìn)展，但是心梗后心衰的死亡率和發(fā)病率仍然居高不下。原因在于目前的治療措施僅能夠暫時(shí)延緩疾病的進(jìn)展，未得到及時(shí)再灌注的心梗患者的心肌在接下來會(huì)出現(xiàn)較大的瘢痕組織以及嚴(yán)重的左室功能不全。鑒于上述情況，急需新的能夠再生梗塞心肌，修復(fù)

2、心梗后心臟的治療措施出現(xiàn)，從而逆轉(zhuǎn)心衰患者的不良預(yù)后。
　　心臟組織工程及生物材料工程主要基于應(yīng)用人工合成的或天然生物基質(zhì)材料構(gòu)建可收縮的類心肌組織從而逆轉(zhuǎn)心衰的進(jìn)展。鑒于可注入型天然生物材料可通過微創(chuàng)形式注入體內(nèi)，因而成為目前研究的熱點(diǎn)1。Wangde Dai等人2通過研究已經(jīng)證實(shí)向大鼠心梗心肌內(nèi)注入心肌組織源性的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能夠增加心梗后的左室壁厚度，防止左室矛盾性收縮膨出，改善心梗后的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)

3、。并且這種治療益處并不依賴于局部血管生成增多或者募集內(nèi)源性干細(xì)胞向心肌損失部位遷徙。
　　CDCs(心肌球源性心肌干細(xì)胞)是一種富集心肌祖細(xì)胞和支持細(xì)胞的心肌源性干細(xì)胞。這種細(xì)胞能夠自我更新并且無論在體還是離體，均能夠向心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞分化3。它們能夠促進(jìn)心梗小鼠的心肌細(xì)胞再生并且改善心功能4。無免疫抑制措施移植同種異體CDCs治療大鼠心梗是安全有效的，能夠促進(jìn)心肌再生，從而改善心臟功能。這項(xiàng)研究結(jié)果鼓舞人們進(jìn)一步將人類的同種異

4、體CDCs作為一種潛在的現(xiàn)成的細(xì)胞心肌成型產(chǎn)品5。Malliaras K等人通過研究證實(shí)，與安慰劑組比較，向Yucatan迷你豬心梗心肌組織內(nèi)移植同種異體CDCs治療心梗，能夠減輕左室重構(gòu)，改善心肌整體和局部功能，降低心梗瘢痕面積，并且還能夠增加存活心肌組織量6。還有研究證實(shí)源于重度心衰病人心肌的CDCs具有較強(qiáng)的改善心梗后左室功能不全的潛能，其可能機(jī)制為通過SDF-1介導(dǎo)7。
　　然而，移植到宿主心肌內(nèi)干細(xì)胞的定植率和長期存活率

5、非常有限。其機(jī)制可能為移植到宿主心肌內(nèi)的干細(xì)胞通過血液沖刷和心肌擠壓而丟失8，9?？勺⑷胄吞烊簧锊牧峡捎米饕浦哺杉?xì)胞載體從而增加移植干細(xì)胞的定植率和存活率10,11,12。還有研究表明直接直接心肌內(nèi)注入途徑的干細(xì)胞較經(jīng)冠脈途徑注入的干細(xì)胞定植率存活率要高13。因此我們擬采用直接心肌內(nèi)干細(xì)胞注入途徑移植干細(xì)胞。
　　基于上述討論的臨床前期研究經(jīng)驗(yàn)，且考慮到自體干細(xì)胞移植所取得的的令人鼓舞的研究結(jié)果14,15，已經(jīng)有基于同種異體心肌

6、源性干細(xì)胞治療急性心梗的兩項(xiàng)臨床研究正在進(jìn)行(ALLSTAR，CAREMI)。且源于同種異體心肌干細(xì)胞的初期研究結(jié)果令人鼓舞。
　　雖然單獨(dú)應(yīng)用同種異體CDCs的治療結(jié)果令人鼓舞，我們?cè)诳紤]將CDCs聯(lián)合天然生物材料能夠增加CDCs的治療價(jià)值。在目前的研究中，我們擬研究在大鼠心梗模型中，CDCs聯(lián)合心肌組織源性的ECM是否能夠促進(jìn)離體和在體CDCs的增殖，分化;是否能夠增加心梗左室壁厚度，改善左室功能以及提高移植入大鼠心肌內(nèi)CDC

7、s的定植率以及遠(yuǎn)期存活率。從而為今后心梗及心衰的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、CDC體外培養(yǎng)及生長分化的觀察研究及心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備及檢測(cè)
　　由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠(體重170-180g)心臟，培養(yǎng)CDC。即采用心肌組織塊培養(yǎng)法，采用CEM培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細(xì)胞(EDC);原代細(xì)胞平鋪于PDL包被的12孔培養(yǎng)板上，平鋪密度為40000-50000/孔，采

8、用CGM培養(yǎng)液培養(yǎng)出“心肌球”(CS);采集“心肌球”，12孔培養(yǎng)板上每3個(gè)孔所搜集的“心肌球”平鋪于1個(gè)60mm FN包被的培養(yǎng)皿上，CEM培養(yǎng)液培養(yǎng);“心肌球”平鋪5-7天后，采集CDC，用于凋亡及下一步細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，平鋪生長14天的CDC用于熒光鑒定其分化。對(duì)比常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿及ECM+FN包被的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)的CDC凋亡率;CDC生長14天后，免疫熒光鑒定CDC分化情況，對(duì)比常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿及ECM+FN包被的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)

9、的CDCα-SA，α-SMA，v-WF表達(dá)情況及表達(dá)率;MTT法對(duì)比常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿及ECM+FN包被的培養(yǎng)皿所培養(yǎng)的CDC的生長曲線，時(shí)間點(diǎn)分別為12h，1d，3d，7d，14d.
　　實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雌性Wistar大鼠若干用于制備ECM，體重210±1.32g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部中心提供。Wistar大鼠（雌性，體重約200克）10％水合氯醛麻醉后取其心臟，清除脂肪組織，用無菌眼科剪刀將其箭成厚度約1-mm組織碎片。將

10、剪好的組織片置于50 mL無菌離心管中并浸入無菌D-PBS溶液中洗滌，后浸入無菌3.4 mol/L NaCl溶液中，用組織粉碎機(jī)(IKA，Wilmington，NorthCarolina)將組織碎片做成勻漿懸液，4℃搖床搖勻（130rpm）30分鐘。3000rpm室溫離心10分鐘，去上清。加入50 units/mL DNAse and10 mg/mL of RNAse的無菌PBS溶液中，4℃搖床搖勻（130rpm）1小時(shí)，以便充分去除所

11、有核酸物質(zhì)。3000rpm室溫離心10分鐘，去上清。更換1％ TritonⅩ-100溶液，4℃搖床搖勻(130rpm)1小時(shí)。3000rpm室溫離心10分鐘，去上清。更換無菌PBS溶液，4℃搖床搖勻(130rpm)1小時(shí)。3000rpm室溫離心10分鐘，去上清。重復(fù)8，9過程2次，將得到的ECM置于-80℃保存?zhèn)溆?。體重200克左右的大鼠心臟可制備10毫克的ECM.I型鼠尾膠原膠（3.75mg/ml）3ml+10×MEM1 ml+nuc

12、lease free無菌水6ml，配置成10ml濃度為1mg/ml的一型鼠尾膠原膠溶液，向10ml濃度為1mg/ml的一型鼠尾膠原膠溶液中加入幾滴（大概2.5滴）1N NaOH溶液（無菌）震蕩搖勻，可見溶液顏色由黃變紅。將10mgECM粉末加入其中，制備成1mg/ml的ECM溶液，可應(yīng)用于心肌內(nèi)注射。HE染色檢測(cè)ECM中是否有細(xì)胞成分殘余。
　　二、CDC聯(lián)合心室肌細(xì)胞外基質(zhì)治療大鼠急性心梗的效果研究及
　　通過熒光定量PC

13、R檢測(cè)雄性大鼠sry基因片段半定量比較移植CDC的定植和存活
　　實(shí)驗(yàn)清潔級(jí)雌性Wistar大鼠48只，E組，EC組，I組，IC組各12只，用于造心梗模型及接受雄性Wistar CDC細(xì)胞，體重210g左右，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　10％水合氯醛麻醉大鼠，氣管切開直視下插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，胸骨左緣2，3肋間入胸，結(jié)扎左前降支近中段，制造大鼠心梗模型，分四組28-gauge注射器于心梗交界4點(diǎn)注射法于梗塞區(qū)域內(nèi)

14、心肌內(nèi):150ul IMDM(Gibco)（對(duì)照組I組，n=12），150ul空白ECM懸液（空白組E組，n=12），150ulECM懸液包含1×106CDCs（EC組，n=12），150ul IMDM(Gibco)包含1×106CDCs(IC組，n=12)，小動(dòng)物心臟彩超測(cè)量各組大鼠心梗前，心梗后6h及心梗后3W各組間IVS，LVEF，EDV，ESV，F(xiàn)S％，LVIDd，LVIDds，然后處死大鼠，取材心臟。10％福爾馬林固定。常規(guī)石

15、蠟包埋，切片，行Masson染色。定量對(duì)比分析心梗纖維化面積百分比及積分OD值。免疫熒光法檢測(cè)各組心梗后1周和心梗后3周心梗周邊心肌組織切片表達(dá)α-SA，α-SMA，v-WF及c-kit表達(dá);定量對(duì)比分析陽性面積百分比及積分OD值。采用WB法檢測(cè)各組心梗后3周α-SA，α-SMA，v-WF及c-kit表達(dá)，并定量對(duì)比分析，選用β-actin做內(nèi)參。
　　由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雌性Wistar大鼠36只，體重200-

16、210g，EC組，IC組各12只，對(duì)照組雌性大鼠僅接受心梗造模無CDC移植，接受雄性Wistar CDC細(xì)胞，分別于心梗后24小時(shí)及3W通過熒光定量PCR檢測(cè)雌性大鼠心肌內(nèi)雄性Wistar大鼠sry基因片段，從而對(duì)比兩組(EC組，IC組)在急性心梗移植CDC后24小時(shí)和3周的干細(xì)胞在心肌組織內(nèi)定植及存活情況(2-△△CT法)。
　　結(jié)果：
　　一、CDC體外培養(yǎng)及生長分化的觀察研究及心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備及檢測(cè)

17、>　　心肌組織塊平鋪FN包被的培養(yǎng)皿3-5天后，從心肌組織塊中生長出EDC，包括纖維細(xì)胞樣和在倒置顯微鏡下觀察為小圓亮2種形態(tài)細(xì)胞。CDC平鋪于PDL包被的12孔培養(yǎng)板后5-7天可生長出一代心肌球，采集一代心肌球平鋪于FN包被的60mm培養(yǎng)皿后3-5天生長出CDC。體外免疫熒光檢測(cè)提示心肌球中心部為大量表達(dá)c-kit的細(xì)胞，心肌球平鋪后的CDC也表達(dá)c-kit。體外熒光鑒定提示ECM包被的培養(yǎng)皿內(nèi)生長的CDCα-SA，α-SMA，v-W

18、F表達(dá)率較常規(guī)FN包被的培養(yǎng)皿內(nèi)生長的CDC的表達(dá)率顯著增高，且ECM包被的培養(yǎng)皿內(nèi)生長的CDC具有較高的增殖活力以及較低的凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　本實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的制備方法可徹底清除細(xì)胞成分，并完整的保留了ECM的成分及結(jié)構(gòu)。
　　二、CDC聯(lián)合心室肌細(xì)胞外基質(zhì)治療大鼠急性心梗的效果研究及通過熒光定量PCR檢測(cè)雄性大鼠sry基因片段半定量比較移植CDC的定植和存活
　　四組（E組，EC

19、組，I組，IC組）心梗造模前大鼠體重?zé)o明顯差異。各組間心梗造模前及造模后IVS，EDV，ESV，IVEF，F(xiàn)S％，LVIDd，LVIDs均無明顯差異。心梗造模后3周E組，EC組，IC組與I組相比，IVS，EDV，ESV，IVEF，F(xiàn)S％，LVIDd，LVIDs有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中E組與IC組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。心梗3周后，Masson染色法提示與IC組比較，EC組心梗后纖維化陽性面積百分比及纖維化積分光密度OD值均明顯降低。AMI后1周及3周

20、，免疫熒光檢測(cè)提示與IC組比較，EC組心肌組織切片內(nèi)α-SA，c-kit，α-SMA，v-WF陽性表達(dá)面積百分比及積分OD值顯著增高。心梗后3周，WB檢測(cè)提示與IC組比較，EC組c-kit，v-WF，α-SA，α-SMA表達(dá)顯著增加（β-actin為內(nèi)參）。
　　心梗24小時(shí)及3周后，分別取EC組合IC組大鼠心梗周邊心肌組織，提取組織DNA，通過熒光定量PCR（2-△△CT法）檢測(cè)雄性大鼠sry基因片段半定量分析提示與IC組比較，

21、無論心梗后24小時(shí)還是3周后，EC組CDC具有顯著增高的定植率及存活率。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)法可獲得表達(dá)c-kit的CDC細(xì)胞，體外研究證實(shí)ECM可促進(jìn)CDC向血管內(nèi)皮，血管平滑肌，心肌細(xì)胞分化;促進(jìn)增殖，減少凋亡。
　　2、本實(shí)驗(yàn)中脫細(xì)胞法提取心肌ECM可有效脫掉心肌組織中的細(xì)胞成分，且較好的保留了心肌ECM的成分和結(jié)構(gòu)。
　　3、在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDC聯(lián)合ECM治療大鼠急性心梗能夠改善心臟功能及心