小鼠胚胎心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流性鉀電流(IK1)的發(fā)育依賴.pdf

1、IK1（inward rectifier potassium channel）是哺乳動(dòng)物心臟中具有強(qiáng)大內(nèi)向整流特性的鉀通道。心肌細(xì)胞動(dòng)作電位發(fā)生過程中，IK1在穩(wěn)定靜息膜電位和三期復(fù)極中起著非常重要的作用。IK1強(qiáng)度減少，可以延長(zhǎng)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，導(dǎo)致長(zhǎng)QT綜合征，即Anderson's syndrome。IK1強(qiáng)度增加，可能導(dǎo)致動(dòng)作電位時(shí)程、有效不應(yīng)期和QT間期縮短，有效不應(yīng)期縮短則容易發(fā)生快速性的室性心律失常，如室性心動(dòng)過速和心

2、室顫動(dòng)等。IK1通道主要由Kir2家族的同聚體或者異聚體所組成，包括Kir2.1，Kir2.2，Kir2.3和Kir2.4亞單位。心肌細(xì)胞中主要含有前三種。近年來諸多研究表明，不同亞單位組裝的IK1具有不同的電生理特性，且具有組織特異性和物種依賴性。胚胎心肌細(xì)胞具有自律性動(dòng)作電位。越來越多的研究表明，胚胎心肌細(xì)胞的某些電生理特性與一些病理情況如心肌肥厚和心力衰竭相似，后者可以反演胚胎心肌細(xì)胞的某些電生理學(xué)特性，因此近年來胚胎心肌細(xì)胞的離

3、子通道電生理學(xué)特性已經(jīng)被廣泛研究，其中IK1也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。在大鼠、犬、兔、雞等的胚胎心臟發(fā)育過程中，IK1密度呈發(fā)育依賴性的增加，但是有關(guān)胚胎小鼠心臟IK1的發(fā)育性特點(diǎn)研究較少，特別是發(fā)育過程中，IK1的電生理學(xué)特性及其亞單位基礎(chǔ)尚不清楚。因此本研究以小鼠胚胎心室肌細(xì)胞為對(duì)象，應(yīng)用鋇離子作為阻斷劑，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR，Western blot和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)研究不同發(fā)育階段的小鼠IK1電生理學(xué)特性及其分子生物學(xué)基

4、礎(chǔ)。本研究為更好理解胚胎心肌基因以及IK1通道的亞單位組成和物種特異性表達(dá)提供進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，為理解和治療心肌肥厚和心力衰竭等疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　 一.小鼠胚胎心室肌細(xì)胞IK1電生理學(xué)特性的發(fā)育依賴性變化
　　 1.IK1密度發(fā)育依賴性增加方法：采用膠原酶B消化獲得單個(gè)小鼠胚胎心室肌細(xì)胞并培養(yǎng)24-36小時(shí)。選擇跳動(dòng)的單個(gè)細(xì)胞,2 mM Ba2+作為阻斷劑，以全細(xì)胞電壓鉗模式使用protocol電壓（為失活鈉通道鉗制電位

5、在-40 mV，測(cè)試脈沖為-120到+60 mV，步階為10 mV，持續(xù)時(shí)間500 ms）記錄心室肌細(xì)胞的Ba2+敏感性電流即IK1。分別記錄胚胎早期（E10.5）和晚期（E17.5）心室肌細(xì)胞的IK1。結(jié)果：含5.4 mM KCl的正常臺(tái)式液中早期和晚期記錄到的IK1均很小，幾乎觀察不到。100 mM 細(xì)胞外K+條件下，早期和晚期都可以記錄到較大的IK1，符合一般IK1的特點(diǎn)。負(fù)于翻轉(zhuǎn)電位時(shí)有相對(duì)較大的內(nèi)向電流，正于翻轉(zhuǎn)電位時(shí)則有相對(duì)

6、較小的外向電流。Ba2+可阻斷該電流，經(jīng)正常外液洗脫后可恢復(fù)。早期和晚期心臟的IK1在激活電壓-120 mV時(shí)均有較大的內(nèi)向電流，分別為-6.72±1.02 pA/pF(n=9）和-92.29±3.03 pA/pF(n=10），晚期比早期有顯著性增加（P＜0.01）。最大外向電流密度早期為0.60±0.32 pA/pF(n=9），晚期為3.27±1.11 pA/pF（n=10），二者有顯著性差異（P＜0.05）
　　 2．IK1

7、內(nèi)向整流特性的發(fā)育依賴性增加方法：采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在100 mM 細(xì)胞外K+條件下記錄心室肌細(xì)胞的Ba2+敏感性電流即IK1，分別對(duì)小鼠胚胎早期和晚期IK1 I-V曲線經(jīng)Boltzmann方程擬合計(jì)算翻轉(zhuǎn)電位數(shù)值，Gauss方程擬合計(jì)算最大外向電流激活電壓，以負(fù)于翻轉(zhuǎn)電位30 mV內(nèi)向電流數(shù)值與正于翻轉(zhuǎn)電位20 mV外向電流數(shù)值的比值作為公式計(jì)算早期和晚期IK1的內(nèi)向整流率（averaged rectification ratio，

8、RR），分別對(duì)應(yīng)于-40 mV和+10 mV，即RR=IK1(-40 mV)/IK1(10 mV)，研究比較胚胎早期(E10.5d）和晚期（E17.5d）IK1的內(nèi)向整流特性。結(jié)果：早期IK1的翻轉(zhuǎn)電位為-11.55±4.55 mV(n=9），晚期的為-18.41±8.68 mV（n=10），二者沒有顯著性差別（P>0.05）。但I(xiàn)K1內(nèi)向整流特性有明顯變化：最大外向電流激活電壓早期為22.58±2.42 mV（n=9），晚期為18.3

9、2±0.79 mV(n=10），早期有更加正向的最大外向電流激活電壓；平均內(nèi)向整流率RR晚期（-13.39±1.9，n=9）幾乎為早期（3.36±0.92，n=10）的4倍，表明了晚期比早期胚胎小鼠心室肌細(xì)胞的IK1有更強(qiáng)大的內(nèi)向整流特性。
　　 3.IK1激活動(dòng)力學(xué)發(fā)育依賴性增快方法：IK1記錄方法同前，電壓Protocol（為失活鈉通道鉗制電位在-40 mV，測(cè)試脈沖為-120到-20 mV，步階為20 mV，持續(xù)時(shí)間500

10、 ms），為了更清楚觀察胚胎小鼠早期和晚期心室肌細(xì)胞的IK1的激活情況，我們選擇激活時(shí)間在前100 ms的電流進(jìn)行指數(shù)方程擬合并計(jì)算IK1激活動(dòng)力學(xué)Tau值，研究比較胚胎早期(E10.5）和晚期（E17.5）IK1激活動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)。結(jié)果：在發(fā)育過程中，IK1表現(xiàn)了不同的激活動(dòng)力學(xué)特性。早期和晚期IK1均有偽瞬時(shí)（pseudoinstantaneous）激活的特性，緊接著是一個(gè)比較慢的單指數(shù)激活電流。后者經(jīng)過擬合，早期Tau值（6.14±

11、0.32 ms，n=9）明顯大于晚期的Tau值，（0.85±0.14 ms，n=10），兩者具有顯著性差異（P＜0.01）。
　　 二 小鼠胚胎心室肌細(xì)胞IK1通道亞單位的發(fā)育依賴性變化1.不同IK1亞單位mRNA的發(fā)育依賴性改變方法：采用半定量RT-PCR和Real time PCR技術(shù)，比較早期（E10.5）和晚期（E17.5）小鼠胚胎心室肌組織Kir2.1，Kir2.2和Kir2.3 mRNA的異同。結(jié)論：通過對(duì)比早期和晚

12、期胚胎小鼠心室肌細(xì)胞IK1的電生理特點(diǎn)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其對(duì)動(dòng)作電位的貢獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)① 與早期相比，晚期胚胎小鼠心室肌細(xì)胞上的IK1通道電流密度增加，激活動(dòng)力學(xué)增快，內(nèi)向整流特性增強(qiáng)。② IK1通道電生理學(xué)特性發(fā)育依賴性變化的分子生物學(xué)基礎(chǔ)：早期IK1通道亞單位Kir2.1和Kir2.3占主導(dǎo)。隨著發(fā)育Kir2.1表達(dá)上調(diào)，Kir2.3表達(dá)下調(diào)，使得晚期Kir2.1表達(dá)占主導(dǎo)。③ IK1通道的功能性作用在早晚期胚胎小鼠心室肌細(xì)胞是不同的