C57BL-6小鼠肝臟微粒體膜蛋白表達(dá)譜的研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)被認(rèn)為是貫穿胞漿的一種生物膜性細(xì)胞器，根據(jù)其是否結(jié)合核糖體將其分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticulum，rER)、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(smooth endoplasmic reticulum，sER)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有參與蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)，糖原分解和脂類、膽固醇合成等功能。在肝臟中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與內(nèi)源的疏水代謝物和異源物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，與ER相關(guān)的功能蛋白質(zhì)

2、大多為膜結(jié)合蛋白質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的失調(diào)能引起細(xì)胞功能異常和一系列疾病。因此，為了深入了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝臟中所發(fā)揮的重要功能，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法系統(tǒng)發(fā)掘C57BL/6小鼠肝臟微粒體膜蛋白信息。 對生物系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要利用凝膠電泳結(jié)合肽指紋法進(jìn)行鑒定。目前，廣泛應(yīng)用的2-DE技術(shù)對蛋白質(zhì)分離效果很好，在一塊膠上可分離10000蛋白質(zhì)，但其最大缺點(diǎn)是對膜蛋白質(zhì)的分離效果很差，特別是在多蛋白質(zhì)復(fù)合體、亞細(xì)胞器或者膜蛋白質(zhì)組的研

3、究中將是致命的。因此，本研究通過離心法建立了小鼠肝臟微粒體提取的平臺，采用免疫印跡和電鏡的方式觀測微粒體提純的程度，最后采用一維凝膠電泳和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定疏水部分，本研究總共獲得548個蛋白。根據(jù)SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫注釋，明確定位于肝臟的有143個蛋白質(zhì)，其中明確注釋為ER的有39個蛋白質(zhì)，未知定位的有35個蛋白質(zhì)；注釋為其他組織的有75個蛋白質(zhì)，其中注釋為ER的有7個，未知定位的有39個；SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫未明確

4、表達(dá)組織的有331個蛋白質(zhì)，其中明確為ER的有66個蛋白質(zhì)，未知定位的有131個蛋白質(zhì)，包括10新蛋白質(zhì)。 利用swiss-prot在線軟件整體上對本研究所獲蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。然后利用Gene Ontology(http：∥www.ebi.ac.uk/ego/)開發(fā)的軟件GOfact工具對小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)譜進(jìn)行功能以及定位信息進(jìn)行分析，功能上認(rèn)為小鼠肝臟微粒體正常發(fā)揮功能且主要為合成膜蛋白和外分泌蛋白，結(jié)構(gòu)域分析驗證

5、了此結(jié)論；定位上，胞漿蛋白質(zhì)污染基本去除，說明微粒體膜的提取效果好。 作為蛋白質(zhì)合成的主要細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一方面選擇性運(yùn)出分泌蛋白和膜蛋白，另一方面保留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白以維持其結(jié)構(gòu)和功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保持駐留蛋白主要通過兩種方式完成：阻止其進(jìn)入運(yùn)輸小泡而停留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白進(jìn)入轉(zhuǎn)運(yùn)小泡后重新運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位是通過周密調(diào)控的。研究發(fā)現(xiàn)在微粒體膜蛋白質(zhì)中有156個蛋白約28.47％具有已確定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號。與已有的微

6、粒體相關(guān)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)異物代謝酶P450家族在rER和sER中分布無明顯變化，同時大鼠與小鼠中P450家族蛋白質(zhì)在序列上有較大變化。核糖體蛋白質(zhì)在序列上比P450家族蛋白質(zhì)在進(jìn)化上更保守，sER與rER相比核糖體數(shù)目變化不大，但是蛋白質(zhì)豐度變化明顯。 總之，通過研究得到高度富集的微粒體膜，在此基礎(chǔ)上建立了小鼠肝臟微粒體膜蛋白質(zhì)表達(dá)譜，確定了548個微粒體蛋白質(zhì)，并利用生物信息學(xué)手段對其進(jìn)行了生物學(xué)解讀以及與已有的微粒體相