C57BL-6小鼠重組甘丙肽基因的克隆與轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建.pdf

1、目的：克隆C57BL/6小鼠重組甘丙肽基因，構(gòu)建其過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體，為制作轉(zhuǎn)基因動物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分別克隆C57 BL/6小鼠甘丙肽基因cDNA與第二內(nèi)含子DNA片段，然后用PCR對二者進(jìn)行重組，得到Galanin-intron2片段。Galanin-intron2與人的血小板源性生長因子B鏈(platelet-derived growt

2、h factor Bchain，PDGF-B)基因啟動子共同克隆至pSP73載體，Galanin-intron2位于PDGF-B啟動子下游，構(gòu)建C57 BL/6小鼠甘丙肽過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體pSP73-PDGFB-Gal-intron2。
　　 1.從健康成年C57BL/6小鼠大腦組織中提取總RNA和基因組DNA;在GenBank中查詢已知的甘丙肽基因序列，用軟件Primer5.0設(shè)計特異引物；通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReverseTra

3、nscription-PCR，RT-PCR)擴(kuò)增出甘丙肽cDNA序列；通過普通PCR擴(kuò)增出甘丙肽基因5'端非編碼cDNA序列(5'Non-coding Region，5'NCR)、3'端非編碼cDNA序列(5'Non-codingRegion,3'NCR)及第二內(nèi)含子(itron2)。以cDNA和5'NCR的PCR產(chǎn)物混合物為模板，通過重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE-PCR)擴(kuò)增甘丙肽外顯子1-2(ex

4、on1-2)；以cDNA和3'NCR的PCR產(chǎn)物混合物為模板，OE-PCR擴(kuò)增甘丙肽基因外顯子3-6(exon3-6)；以exon1-2，exon3-6及itron2 PCR產(chǎn)物混合物為模板，經(jīng)OE-PCR擴(kuò)增本次實(shí)驗(yàn)所需的甘丙肽目的基因片段Galanin-intron2。
　　 2.Galanin-intron2 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳膠回收純化，再經(jīng)加A反應(yīng)后，通過T-A克隆于pGEM-easyT載體，酶切后經(jīng)電泳鑒定及

5、DNA測序，命名為pGEMT-Gal-intron2。
　　 3.HindⅢ與XhoⅠ酶切pGEMT-Gal-intron2得到Galanin-intron2片段，XbaⅠ與HindⅢ酶切psisCAT6α質(zhì)粒得到PDGF-B啟動子，XbaⅠ與XhoⅠ酶切pSP73載體，將Galanin-intron2片段與PDGF-B啟動子連接入pSP73載體，命名為pSP73-PDGFB-Gal-intron2。
　　 結(jié)果：獲得帶