ECFP-SUMO-EYFP融合基因的構建、表達及其鑒定.pdf

1、目的： 通過Gateway技術結合酶切連接的方法，將ECFP基因、CYFP基因與人SUMO基因連接起來形成ECFP-SUMO-EYFP融合基因，并將此基因在大腸桿菌BL21中表達，為進一步的熒光共振能量轉移研究打下實驗基礎。 方法： 1.通過PCR技術將ECFP基因擴增出來，并通過兩步法PCR反應和BP反應將ECFP基因片段克隆到到質粒pDeliver02，構建入門克隆ECFP Dev02，并經過提取質粒、

2、經酶切鑒定，并測序確定。 2.通過PCR技術將EYFP基因擴增出來，并通過兩步法PCR反應和BP反應將EYFP基因片段克隆到到質粒pDeliver01，構建入門克隆EYFP Dev01，并經過提取質粒、經酶切鑒定，并測序確定。再通過酶切、連接和RJ反應，將EYFP基因克隆到表達載體pReceiver-B01.1中，構建表達載體EYFP B01.1。 3.構建融合基因：PCR擴增SUMO1，SUMO2，SUMO3基因，

3、通過酶切、連接，與EYFP B01.1構建融合的SUMO1-EYFP B01.1，SUMO2-EYFP B01.1，SUMO3-EYFP B01.1表達載體；PCR擴增ECFP基因，純化該基因，通過酶切、連接，分別與SUMO1-EYFP B01.1，SUMO2-EYFP B01.1，SUMO3-EYFPB01.1構建ECFP-SUMO1-EYFP B01.1， ECFP-SUMO2-EYFP B01.1，ECFP-SUMO3-EYFP

4、B01.1融合基因表達載體。 4.融合基因ECFP-SUMO1-EYFP，ECFP-SUMO2-EYFP，ECFP-SUMO3-EYFP分別在大腸桿菌BL21中表達并純化，通過用SDS-PAGE鑒定融合基因，并通過Ni-NTA離子交換柱層析純化，最終得到純化后的融合蛋白，并以酶切實驗初步分析了SENP相對于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特異性。 結果： 1.成功的構建入門克隆ECFP Dev02和E

5、YFP Dev01，成功構建表達載體EYFPB01.1。 2.成功的構建融合基因ECFP-SUMOs-EYFP，并同時構建SUMOs三種亞型的融合基因。 3.ECFP-SUMO-EYFP蛋白在大腸桿菌BL21獲得可溶性表達，SDS-PAGE分析表明表達產物分子質量(Mr)與預期相符，ULP、SENPs對底物ECFP-SUMOs-EYFP的酶切特異性檢測表明ECFP-SUMOs-EYFP可被有效酶切用于熒光共振能量轉移