肝衰竭環(huán)境下清熱解毒涼血化瘀法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:通過大鼠血清建立干細(xì)胞移植治療肝衰竭體外模型，進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。觀測(cè)在肝衰竭環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化及免疫調(diào)節(jié)情況，以及在肝衰竭環(huán)境中清熱解毒涼血化瘀法對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。進(jìn)一步從細(xì)胞層面探索在肝衰竭環(huán)境中清熱解毒涼血化瘀法與間充質(zhì)干細(xì)胞的協(xié)同作用。
　　研究方法:
　　1、大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代篩選:從3-4周齡SPF級(jí)SD大鼠骨髓中提取、分離、培養(yǎng)BMSCs。運(yùn)用全骨髓培養(yǎng)法及傳代篩選法

2、進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及純化。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到80～90％時(shí)，進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。細(xì)胞傳代到第3代時(shí)用于進(jìn)一步的檢測(cè)及移植。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞儀鑒定證明實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞為BMSCs。
　　2、實(shí)驗(yàn)血清的制備:將30只大鼠分為模型組及健康組，模型組21只大鼠通過腹腔注射D-GalN制造肝衰竭大鼠模型。48h后隨機(jī)從模型組和健康組各抽取大鼠3只，采集肝組織進(jìn)行病理切片，驗(yàn)證造模成功。再將模型大鼠14只平均分為中藥干預(yù)組和肝衰竭組，中藥干預(yù)組予以肝毒

3、清顆粒灌胃，肝衰竭組和健康組予以等劑量生理鹽水灌胃。3組大鼠灌胃3天后，腹主動(dòng)脈采血并分離血清，過濾除菌，制備成中藥干預(yù)血清、肝衰竭血清、健康血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　3、建立肝衰竭模擬環(huán)境下骨髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系，采集并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)
　　將第3代BMSCs接種于96孔板、6孔板及24孔板中，各設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別加入健康血清、肝衰竭血清、中藥干預(yù)血清進(jìn)行BMSCs培養(yǎng)。
　　96孔板中培養(yǎng)BMSCs，每組

4、設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)1d，2d，3d時(shí)終止培養(yǎng)，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。觀察BMSCs的增殖存活情況。
　　24孔板中培養(yǎng)BMSCs，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，做爬片處理，培養(yǎng)10d后，終止培養(yǎng)，并制作CK18免疫熒光爬片。通過免疫熒光顯微鏡檢測(cè)BMSCs肝向分化情況。
　　6孔板中培養(yǎng)BMSCs，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)10d后，終止培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白，并通過Western blot法檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)

5、、肝組織白蛋白(ALB)、吲哚胺2，3—雙加氧酶(IDO)，分析BMSCs肝向分化及免疫調(diào)節(jié)活性。
　　研究結(jié)果:
　　1、將BMSCs置于各組血清中培養(yǎng)1天、2天時(shí)，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示:健康組、肝衰竭組、中藥干預(yù)組，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第3天時(shí)，CCK-8檢測(cè)結(jié)果示:健康組與肝衰竭組，健康組與中藥干預(yù)組的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而肝衰竭組與中藥干預(yù)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但在細(xì)胞培養(yǎng)10天后觀察發(fā)現(xiàn)，中藥干預(yù)組細(xì)胞生長(zhǎng)明

6、顯優(yōu)于肝衰竭組。
　　2、BMSCs制作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)10天后進(jìn)行CK18免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示健康組染色為陰性，肝衰竭組及中藥干預(yù)組染色為陽性，后者染色較強(qiáng)，但均明顯弱于肝細(xì)胞染色。推測(cè)BMSCs肝向分化過程中細(xì)胞分化數(shù)量或細(xì)胞成熟度較低。
　　3、BMSCs培養(yǎng)10天后通過Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。ALB蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:健康組、肝衰竭組、中藥干預(yù)組均有表達(dá)，且依次遞增，各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其表達(dá)量

7、較少。AFP蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:健康組、肝衰竭組、中藥干預(yù)組表達(dá)強(qiáng)度依次增強(qiáng)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、BMSCs培養(yǎng)10天后通過Western blot法檢測(cè)IDO表達(dá)，結(jié)果顯示:健康組IDO蛋白無明顯表達(dá)。IDO蛋白在中藥干預(yù)組中的表達(dá)高于肝衰竭組，且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)論:
　　通過建立BMSCs移植治療肝衰竭體外模型，觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs在肝衰竭環(huán)境中增殖活性相對(duì)下降，具有肝向分化趨勢(shì)，及