改良的氣體環(huán)境對體外骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)影響的實驗研究.pdf

1、在組織工程瓣膜（tissue engineering heart valve，TEHV）的研究過程中，如何短時間獲取大量功能狀態(tài)良好的骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），維持MSCs的原始狀態(tài)，及控制MSCs分化方向是當前研究的熱點。影響MSCs生長、功能狀態(tài)及分化的因素很多，包括O2濃度、PH值、溫度、生長因子、血清、培養(yǎng)基、剪切力、細胞密度等。微環(huán)境中O2濃度及PH值是非常重要因素：O2對MS

2、Cs的影響是多個方面的，適當?shù)腛2濃度可以促進MSCs的增殖、分化、原始狀態(tài)的維持；MSCs對培養(yǎng)環(huán)境的PH值的變化非常敏感，不同PH值對MSCs的增殖、分化及生物學功能有著顯著影響。目前傳統(tǒng)的細胞體外培養(yǎng)環(huán)境中O2濃度約為21％，CO2濃度約為5％，所用培養(yǎng)基PH值為7.2～7.4。而人體正常組織和組織間隙中的O2濃度3％～9％，骨髓腔內(nèi)O2濃度1％～7％；動脈血CO2濃度約5％,靜脈血CO2濃度約6％,骨髓腔內(nèi)CO2濃度約7％；人體

3、動靜脈血液及骨髓腔內(nèi)pH值恒定在7.20～7.50間。目前，低氧環(huán)境能顯著影響干細胞的增殖和生長因子的分泌，但未見低氧對種子細胞黏附功能影響的研究報道。為此，我們分別采用6％O2的培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)MSCs，探討低氧環(huán)境對MSCs增殖功能及粘附功能影響。同時針對傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)液如DMEM,DF-12,M199等均隨著使用或存放時間的延長，培養(yǎng)液的pH值會明顯升高，我們首次嘗試7％CO2環(huán)境來增強培養(yǎng)液中CO2/HCO3-緩沖能力，穩(wěn)定培養(yǎng)液p

4、H值，探討此種穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境對MSCs增殖及細胞原始狀態(tài)的影響，旨在探索合適的細胞培養(yǎng)的條件。
　　第一部分：小鼠MSCs細胞分離、純化、擴增并鑒定：經(jīng)Percoll密度梯度離心和貼壁生長的方法從采集的小鼠骨髓液中提取，倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，通過免疫組化及流式細胞儀來進行鑒定。
　　結(jié)果：選取的6個培養(yǎng)瓶的小鼠MSCs，進行免疫組化染色顯示：ɑ-SMA,Vimentin均呈陽性表達；小鼠MSCs流式細胞儀鑒定示：CD29,C

5、D44,CD90及CD105呈現(xiàn)高度陽性表達，陽性率分別為92.7％，99.6％，99.5％及99.4％，而CD34和CD45陽性表達率僅分別為4.6％和3.2％。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　第二部分：6％O2與21％O2條件下小鼠MSCs增殖、粘附及細胞外基質(zhì)表達量的比較：兩組間各挑選生長良好的3代對數(shù)生長期細胞，一共分為6個對照組，分別進行增殖實驗，粘附實驗，及通過Western-blotti

6、ng測定FN及VN的表達，初步評價兩種不同O2環(huán)境下MSCs的增殖、分泌及粘附功能狀態(tài)。
　　結(jié)果：6％O2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較21％O2有更強的增殖能力(p<0.05)、粘附能力(p<0.05)及分泌功能(p<0.05)。
　　第三部分：7％CO2與5％O2條件下小鼠MSCs增殖能力及OCT-4蛋白表達量的比較：兩組間各挑選生長良好的3代對數(shù)生長期細胞，一共分為6個對照組，分別進行增殖實驗，及通過Western-bl

7、otting測定OCT-4蛋白的表達，初步評價兩種不同CO2環(huán)境下MSCs的增殖及干細胞原始狀態(tài)的維持。
　　結(jié)果：7％CO2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較5％CO2有更強的增殖能力(P<0.05)；同時OCT-4蛋白的表達含量也較高，表明7％CO2條件更有利于小鼠MSCs原始狀態(tài)的維持(P<0.05)。
　　第四部分：7％CO2+6％O2與5％CO2+6％O2條件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始狀態(tài)維持的比較：兩組間各挑選生長良

8、好的3代對數(shù)生長期細胞，一共分為6個對照組，分別進行增殖實驗，粘附實驗，及通過Western-blotting測定FN及OCT-4的表達，初步評價兩種不同氣體環(huán)境下MSCs的增殖、粘附功能及原始狀態(tài)維持。
　　結(jié)果：7％CO2+6％O2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較5％CO2+6％O2有更強的增殖能力(P<0.05)及粘附能力(P<0.05)，同時OCT-4的表達更高(p<0.05)。
　　結(jié)論：O2和PH值是細胞生長的重要的微