基于NF-κB通路探討清熱解毒涼血化瘀法聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療急性肝衰竭模型大鼠的作用機制.pdf

1、研究目的：
　　采用全骨髓貼壁法篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并進行傳代培養(yǎng)及鑒定，同時制備急性肝衰竭伴內(nèi)毒素血癥模型大鼠，通過觀察清熱解毒涼血化瘀中藥聯(lián)合BMSCs移植對模型大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄及肝組織中核因子NF-κB表達的影響來探討該聯(lián)合方法對急性肝衰竭時炎癥反應(yīng)的作用機制。
　　研究方法：
　　1.大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代篩選：無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，并在超凈工作臺中沖洗出骨髓

2、，接種于含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中，定期換液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況,并對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　2.急性肝衰竭大鼠模型的建立并驗證
　　取體重約為180g-200g健康級SD雄性大鼠，硫代乙酞胺（TAA）以400mg/(kg2d)的劑量灌胃，間隔24h后重復(fù)給藥1次。設(shè)置正常組，給予2ml生理鹽水灌胃。造模48h后將存活的大鼠采血、取肝，以檢測血清肝功指標和血漿內(nèi)毒素水平，制作肝組織病理切片，鏡下觀察肝臟結(jié)

3、構(gòu)及炎性細胞浸潤情況，對比正常組，以驗證造模是否成功。
　　3.急性肝衰竭大鼠實驗分組及干預(yù)
　　體重約為180g-200g健康級SD雄性大鼠60只，隨機分為正常組（A組）、TAA模型組（B組）、TAA+甘草酸苷治療組（C組）、TAA+中藥治療組（D組）、TAA+BMSCs治療組（E組）、TAA+BMSCs+中藥組治療組（F組），每組10只。B組、C組、D組、E組、F組給予400mg/kgTAA灌胃，間隔24h后重復(fù)給藥1次

4、，制備ALF大鼠模型。A組給予2ml生理鹽水灌胃。第2次灌胃后將BMSC（約1x107個細胞/只）經(jīng)尾靜脈注射到E、F組大鼠體內(nèi)，A、B、C、D組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等體積的用于培養(yǎng)BMSC的培養(yǎng)液，24h后重復(fù)尾靜脈注射1次。第1次尾靜脈注射后立即予以D、F組大鼠茵陳四苓顆粒灌胃；C組予以甘草酸苷灌胃；A組、B組、E組予以等體積蒸餾水灌胃。干預(yù)治療72h后采血、取肝，檢測血清肝功指標、血漿內(nèi)毒素含量；免疫組化法檢測肝組織中NF-κB的表達

5、；RT-PCR法檢測肝組織TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功分離出貼壁生長的細胞，經(jīng)過3次傳代篩選后細胞形態(tài)逐漸趨向一致，以梭形為主，呈旋渦狀、網(wǎng)狀或放射狀排列。P3代細胞經(jīng)流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示：CD29、CD44細胞陽性率分別為98.2%和97.9%，而CD34、CD45細胞陽性率分別為12.9%和18.7%，符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原表達的特點。
　　2.急性肝衰竭模型的驗證：T

6、AA模型組血清AST、ALT及血漿內(nèi)毒素水平較正常組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。TAA模型組肝組織HE染色顯示：肝索結(jié)構(gòu)大部分被破壞，肝細胞出現(xiàn)片狀壞死、凋亡，大量炎癥細胞浸潤。正常組肝組織HE染色：肝組織細胞排列規(guī)律，結(jié)構(gòu)規(guī)整，細胞形態(tài)正常，無炎癥細胞浸潤。
　　3.急性肝衰竭模型大鼠經(jīng)干預(yù)后的情況：
　?。?）ALT、AST及內(nèi)毒素水平結(jié)果顯示：采取治療的4組（C、D、E、F）大鼠血清 AST、ALT及

7、血漿內(nèi)毒素水平明顯低于模型組（B組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；但各治療組與正常組（A組）對比，AST、ALT、內(nèi)毒素水平仍高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；各治療組相比較，F(xiàn)組大鼠血清AST、ALT及血漿內(nèi)毒素水平較C、D、E組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；C、D、E三組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　（2）RT-PCR結(jié)果顯示：A組肝組織中有少量TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄。B、C、D、

8、E、F組與A組相比，TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。采取治療措施的C、D、E、F組大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯低于模型組（B組），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；各治療組間比較，F(xiàn)組TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平較 C、D、E三組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；C、D、E三組TNF-α、iNOS的基因轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
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9、3）免疫組化結(jié)果顯示：A組肝組織有少量細胞的胞質(zhì)或胞核內(nèi)可見NF-κB的表達。灌胃TAA的其他五組與A組相比較，表達NF-κB的細胞數(shù)目明顯增多，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)干預(yù)后，各治療組（C、D、E、F組）與模型組（B組）相比，NF-κB表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與A組相比，NF-κB表達仍然很高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各治療組間比較，F(xiàn)組表達NF-κB的細胞數(shù)目較C、D、E組有所減少

10、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而C、E、F三組表達NF-κB的細胞數(shù)目相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1.采用全骨髓培養(yǎng)法可成功獲得較高純度的BMSCs，且該方法簡便、快捷、經(jīng)濟，可作為實驗室分離提取BMSCs的常用方法。
　　2.以400mg/(kg2d)劑量的TAA灌胃，每天1次，共灌胃2天，能夠成功建立急性肝衰竭伴內(nèi)毒素血癥大鼠模型。
　　3.肝衰竭時茵陳四苓顆粒、BMS

11、Cs移植均能夠降低血漿內(nèi)毒素含量，兩者聯(lián)合效果更明顯。
　　4.肝衰竭時陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠抑制NF-KB的激活，兩者聯(lián)合效果更明顯。
　　5.肝衰竭時茵陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠減少炎性因子TNF-α、iNOS生成減少，兩者聯(lián)合效果更明顯
　　6.茵陳四苓顆粒聯(lián)合BMSCs移植能夠明顯減輕肝衰竭時肝內(nèi)失控性炎癥反應(yīng)，其機制可能是與減少內(nèi)毒素的生成及吸收，抑制炎癥信號通路NF-KB激活，從而減少其下游