HPVE7通過下調(diào)microRNA-17抵抗化療藥物作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究的目的是以microRNA(miRNA)作為視角，對宮頸癌相關(guān)病毒——人乳頭瘤病毒（HPV）引起腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：
　?。?）MTT法檢測不同濃度多西他賽對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-E7和pcDNA3.1(-)基因的PC3細(xì)胞抑制率；
　?。?）RT-PCR檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化；
　?。?）RT-PCR檢測擬定miRNA表達(dá)情況；
　?。?）計(jì)算

2、機(jī)分析軟件預(yù)測擬定miRNA的潛在靶基因；
　?。?） Western blot檢測miRNA潛在靶基因的蛋白表達(dá)水平變化；
　?。?）重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-CM/miRNA-17-CDK6的構(gòu)建及功能分析；
　?。?）擬定miRNA的類似物/抑制劑(Mimics/Inhibitors)與重組報告基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的功能分析。
　　結(jié)果：
　　(1) MTT結(jié)果提示多西他賽對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E7的PC3細(xì)

3、胞的抑制率較之對轉(zhuǎn)染空載的PC3細(xì)胞的抑制率明顯降低；
　　(2) RT-PCR檢測擬定miRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染E7后miRNA-17的表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞加藥后miRNA-17表達(dá)顯著增加，轉(zhuǎn)染E7的細(xì)胞加藥前后miRNA-17表達(dá)變化不明顯；
　?。?）通過計(jì)算機(jī)預(yù)測分析軟件發(fā)現(xiàn)CDK6是miRNA-17的一個潛在靶基因；
　?。?）RT-PCR檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因——細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶CDK6表達(dá)

4、變化發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染E后CDK6表達(dá)明顯增高；空載組加藥后CDK6表達(dá)明顯降低；而轉(zhuǎn)讓E7組，加藥后CDK6表達(dá)變化不明顯；
　?。?）Western Blot檢測CDK6蛋白水平表達(dá)變化與基因表達(dá)水平相一致；
　　（6）成功構(gòu)建熒光素酶報告基因，經(jīng)過測序鑒定結(jié)果正確。將構(gòu)建的熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染兩組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，再加藥處理后，檢測熒光素酶活性（熒光素酶活性高低與miRNA表達(dá)水平負(fù)相關(guān)），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染E7后，熒光素酶活性顯著升高；而空載

5、組加藥后熒光素酶活性明顯降低；E7組加藥后，熒光素酶活性又有所降低，但變化沒有前者顯著，說明CDK6是miRNA-17潛在一個靶基因;
　?。?）將Mimics/Inhibitors與重組報告基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)E7組轉(zhuǎn)染mimics較轉(zhuǎn)染N.C熒光活性降低，而空載組轉(zhuǎn)染Inhibitor較轉(zhuǎn)染Inhibitor N.C熒光活性顯著增高，進(jìn)一步說明CDK6是miRNA-17潛在一個靶基因。
　　結(jié)論：
　　（1）HPV