肺炎鏈球菌ApnA水解酶SapH和酵母Ap4A磷酸化酶Apa2的結(jié)構(gòu)酶學(xué)研究.pdf

1、二腺苷多聚磷酸(diadenosine polyphosphate，ApnAs)是一種核苷酸衍生物，主要由氨酰tRNA合成酶催化合成，是蛋白質(zhì)合成過程的副產(chǎn)物。它廣泛存在于各種生物中，作為細胞內(nèi)和細胞外的調(diào)控分子發(fā)揮著重要的生理功能。這種核苷酸的在體內(nèi)的積累會對一些關(guān)鍵酶如腺苷酸激酶和蛋白激酶等的活性有抑制作用，因此，生物體內(nèi)ApnA的降解途徑對保持細胞內(nèi)這類核苷酸的穩(wěn)態(tài)是非常重要的。
　　從原核到真核生物都存在著特異性的酶催化A

2、pnA的降解，但在不同的物種中有所差別。降解ApnA的酶主要分為以下幾大類:Nudix(nucleoside diphosphate linked to x)超家族蛋白，HIT(histidine triad)超家族蛋白以及金屬磷酸二酯酶超家族蛋白(metallophosphodiesterase，MPP)。我們選取肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）R6菌株的SapH/Spr1479以及釀酒酵母(Saccha

3、romy cescerevisiae)Apa2為研究目標，其分別屬于MPP超家族和HIT超家族蛋白，均具有降解ApnA的功能，認為在參與ApnA的代謝過程有重要作用。
　　SapH是肺炎鏈球菌R6菌株中的一個分子量為33kDa的功能未知的蛋白。我們通過X-射線晶體學(xué)的方法解析了其apo-form，以及結(jié)合無機磷酸和AMP的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率分別為1.90(A)，2.30(A)和2.20(A)。SapH的核心結(jié)構(gòu)采用四層的α-β-β

4、-α折疊模式，這與MPP超家族蛋白類似。我們通過原子吸收和X-射線反常散射的方法鑒定出其活性中心的雙金屬為Fe3+和Mn2+，并且其與周圍配位的殘基形成正八面體的構(gòu)象。酶活實驗顯示SapH除了具有典型的磷酸二酯酶的通用底物bis-(p-nitrophenyl)phosphate的水解活性外，還具有水解ApnA以及ATP的活性。突變試驗表明金屬配位的殘基對于以上兩種活性都是必須的。然而在復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中結(jié)合磷酸的Trp67僅在鏈球菌中保守，

5、而且僅對ApnA和ATP的水解活性是不可或缺的。同時序列分析表明AMP的結(jié)合殘基僅在鏈球菌中是保守的，因此SapH是鏈球菌特有的一個雙功能酶。
　　釀酒酵母降解Ap4A主要由兩個同源性60％的Ap4A磷酸化酶(Apal和Apa2)完成。Apal和Apa2能可逆地催化Ap4A磷酸解為ATP和ADP，單獨缺失apal,apa2以及雙缺失apal和apa2雖然對釀酒酵母的生長沒有太大影響，但都會導(dǎo)致細胞內(nèi)的Ap4A濃度升高。我們通過X-

6、射線晶體學(xué)的方法解析了Apa2的結(jié)構(gòu)以及H161A突變體與Ap4A復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，分辨率分別為2.3(A)和2.6(A)。Apa2采用α/β折疊模式，核心的β-sheet類似HIT超家族中的GalT(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)家族蛋白，然而額外的亞結(jié)構(gòu)域在Apa2中是特有的，同時也參與形成Ap4A的結(jié)合口袋。Ap4A的結(jié)合口袋可以分為AMP和ATP兩個部分，二者在α-磷酸基團處以互

7、相垂直的方式形成轉(zhuǎn)角，進而將α-磷酸基團暴露給親核攻擊的催化殘基His161，因此Apa2采用類似的GalT家族的雙底物乒乓反應(yīng)催化機制。活性檢測顯示Apa1對Ap4A的相對活性僅為Apa2的1/7。其較低的活性主要是由于Apa2中穩(wěn)定AMP部分的腺嘌呤的Phe68被Apa1的Leu67取代。通過活性分析發(fā)現(xiàn)Apa2對Ap4A的活性最高，kcat/Km為21.0s-1μM-1。Apa2也具有磷酸解Ap3A和Ap5A的活性，但相對活性僅為