唑來(lái)膦酸聯(lián)合特立帕肽防治兔人工膝關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1、成功構(gòu)建鈦顆粒誘導(dǎo)的兔人工膝關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)模型。2、探討唑來(lái)膦酸聯(lián)合特立帕肽防治兔人工膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步研究非手術(shù)方法治療人工膝關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)建立基礎(chǔ)。
　　方法：1、喂養(yǎng)16只成年雄性新西蘭大白兔，平均體重2.85kg，隨機(jī)分為兩組，所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)手術(shù)，取右膝關(guān)節(jié)前正中切口顯露膝關(guān)節(jié)后，從后交叉韌帶股骨側(cè)止點(diǎn)上方開(kāi)口，將長(zhǎng)度2.0cm，直徑0.5cm鈦棒假體沿股骨縱軸方向

2、植入髓腔。實(shí)驗(yàn)組的鈦棒假體表面均勻涂抹50μg直徑20μm的鈦顆粒（試驗(yàn)組），對(duì)照組鈦棒假體表面不涂抹任何物質(zhì)。術(shù)后采取相同圍手術(shù)期處理，喂養(yǎng)12周后處死動(dòng)物，每組動(dòng)物采集如下資料：處死前2天的膝關(guān)節(jié)X線片，滑膜組織行蘇木精-伊紅（H-E）染色，包含假體的骨組織行硬組織切片進(jìn)行Goldner三色染色和Kossa染色分析，假體周?chē)缒そM織行Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)OCN、OPG、RANKL和TRAP5b的m

3、RNA和蛋白含量，進(jìn)行兩組之間的相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比，證實(shí)制備兔人工關(guān)節(jié)假體無(wú)菌性松動(dòng)模型的有效性并明確其機(jī)制。2、繼續(xù)喂養(yǎng)24只新西蘭大白兔，以同樣手術(shù)方式從右側(cè)的股骨膝關(guān)節(jié)面將鈦棒假體沿軸線方向植入髓腔，所有鈦棒假體表面均勻涂抹50μg直徑20μm的鈦顆粒，術(shù)后即給予相關(guān)藥物治療。根據(jù)治療方案不同分為3組，每組8只：分別為唑來(lái)膦酸（ZL）組、特立帕肽（TP）組、唑來(lái)膦酸+特立帕肽(ZL+TP)組，同樣于第12周時(shí)處死動(dòng)物，采集如下資

4、料：處死前2天的膝關(guān)節(jié)X線片，包含假體的骨組織行硬組織切片進(jìn)行Goldner三色染色和Kossa染色，假體周?chē)缒そM織行Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)相關(guān)特異性指標(biāo)的mRNA和蛋白含量。并將第一部分實(shí)驗(yàn)組作為此部分對(duì)照組（CG組）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比分析，驗(yàn)證唑來(lái)膦酸和特立帕肽的單獨(dú)或者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于防治關(guān)節(jié)人工假體無(wú)菌性松動(dòng)作用和機(jī)制。
　　結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物處死前X線可見(jiàn)明顯的假體周?chē)侨芙廑E象；滑膜H-E

5、染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增生并伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。骨硬組織切片行Goldner三色染色顯示實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物假體與骨組織存在較大間隙，間隙由纖維結(jié)締組織填充，假體與骨組織的結(jié)合較差。而對(duì)照組動(dòng)物假體與骨組織的結(jié)合較緊密，周?chē)g隙較小，周?chē)匆?jiàn)明顯纖維組織增生填充。實(shí)驗(yàn)組骨-假體接觸率和骨體積分?jǐn)?shù)低于對(duì)照組。硬組織切片的Von Kossa染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物假體周?chē)拟}鹽沉積島主要是呈線狀，數(shù)量較多，但是面積較小。而對(duì)照組

6、動(dòng)物假體周?chē)拟}鹽沉積島表現(xiàn)為呈星狀，雖然數(shù)量較少，但是單個(gè)面積較大。Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)假體周?chē)鶲CN、OPG、RANKL、TRAP5b的mRNA和蛋白含量顯示，實(shí)驗(yàn)組OCN和OPG的mRNA和蛋白含量低于對(duì)照組，而RANKL和TRAP5b的mRNA和蛋白含量高與對(duì)照組，OPG/RANKL比值明顯低于對(duì)照組。2、CG組、ZL組、TP組和ZL+TP組的影像學(xué)結(jié)果均可見(jiàn)明顯的假體周?chē)侨芙廑E象，4組對(duì)比

7、未見(jiàn)明顯差異。骨硬組織切片行 Goldner三色染色結(jié)果顯示應(yīng)用唑來(lái)膦酸和特立帕肽治療后假體周?chē)墙M織與假體的界面結(jié)合情況均好于對(duì)照組，骨組織較均勻地分布于假體周?chē)w維結(jié)締組織增生較對(duì)照組明顯減輕,尤其是ZL+TP組更明顯。ZL組、TP組和ZL+TP組的骨-假體接觸率和骨體積分?jǐn)?shù)均高于CG組，Von Kossa染色結(jié)果顯示治療后各組假體周?chē)}鹽沉積島排布較對(duì)照組更均勻，主要呈星點(diǎn)狀排列，ZL組、TP組和ZL+TP組的鈣鹽沉積島數(shù)量少于

8、對(duì)照組，而平均面積大于對(duì)照組，以ZL+TP組更顯著。PCR和Western Blot檢測(cè)假體周?chē)鶲CN、OPG、RANKL、TRAP5b的mRNA和蛋白含量顯示，ZL組、TP組和ZL+TP組的OCN的mRNA和蛋白含量高于對(duì)照組，TP組和ZL+TP組升高的量大于ZL組。ZL組、TP組和ZL+TP組TRAP5b的mRNA和蛋白含量低于對(duì)照組，而ZL和ZL+TP組的降低幅度更大；同對(duì)照組的mRNA和蛋白含量相比，ZL組、TP組和ZL+TP組

9、的OPG升高，RANKL降低，OPG/RANKL比值明顯高于于對(duì)照組，尤其以ZL+TP組升高最為顯著。
　　結(jié)論：1、應(yīng)用20μm鈦顆粒涂抹鈦棒假體表面植入兔股骨髓腔使得假體周?chē)a(chǎn)生持續(xù)鈦顆粒刺激，有效誘導(dǎo)假體周?chē)侨芙夂图袤w松動(dòng)產(chǎn)生，主要機(jī)制是鈦顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子，通過(guò)OPG/RANKL/RANK信號(hào)途徑刺激破骨細(xì)胞分化，產(chǎn)生破骨細(xì)胞性骨溶解，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的功能，減少假體周?chē)情L(zhǎng)入。該模型模擬了人工假體植入和松動(dòng)的

10、過(guò)程，經(jīng)濟(jì)、有效，相對(duì)快速，可重復(fù)性強(qiáng)，是研究人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)的理想的病因模型，可以用于病因及生物力學(xué)研究，也可用于多種方式的無(wú)菌性松動(dòng)防治研究。2、唑來(lái)膦酸和特立帕肽可以通過(guò)OPG/RANKL/RANK途徑抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化，并加強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能，起到假體周?chē)侨芙夥乐渭袤w無(wú)菌性松動(dòng)的作用。唑來(lái)膦酸在抑制破骨細(xì)胞活化從而抑制假體周?chē)侨芙夥矫孀饔酶鼜?qiáng)，而特立帕肽在抑制破骨細(xì)胞活化的同時(shí)還可以上調(diào)成骨細(xì)胞功能，具有更強(qiáng)的促進(jìn)假