腺相關(guān)病毒攜帶的骨保護(hù)素基因治療小鼠膝關(guān)節(jié)假體無菌性松動(dòng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 適于長期研究的小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)模型Pin-model的建立背景全關(guān)節(jié)置換是治療晚期關(guān)節(jié)炎常見而有效的治療方案。然而，將近34％的關(guān)節(jié)置換假體將會(huì)發(fā)生無菌性松動(dòng)甚至失敗。因此無菌性松動(dòng)成為假體置換的主要并發(fā)癥。 盡管假體松動(dòng)的具體病理過程目前沒有研究清楚，但越來越多的研究表明，假體周圍磨損顆粒參與誘導(dǎo)的反應(yīng)在其中扮演著重要的角色。普遍認(rèn)為，磨損顆粒激發(fā)了多樣的生物組織反應(yīng)，包括骨假體表面血管肉芽組織的形成，炎癥

2、細(xì)胞聚集(如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集)，骨吸收，以及最終導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松和假體松動(dòng)失敗。如何治療和預(yù)防關(guān)節(jié)假體松動(dòng)成為目前該領(lǐng)域尚待解決的重大課題。 目的： 1.建立一種適于長期研究的小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)動(dòng)物模型(Pin-model)2.探討假體松動(dòng)的病理變化3.檢測(cè)基因治療方案的可行性方法1.小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)動(dòng)物模型的構(gòu)建54只10-12周雌性小鼠，體重20g以上，分為鈦顆粒組(24只)、對(duì)照組(穩(wěn)定組，24只)和基因檢

3、測(cè)組(6只)。沿右膝關(guān)節(jié)旁縱行切開顯露脛骨平臺(tái)，垂直向髓腔鉆入約5mm，置入鈦釘。磨損顆粒實(shí)驗(yàn)組，在術(shù)中鈦釘置入前注射至脛骨髓腔10μl，術(shù)后每月關(guān)節(jié)內(nèi)注射20μl的鈦顆粒。對(duì)照組則注射相同體積的PBS。 分別在術(shù)后2、4、12、24周處死小鼠，取材進(jìn)行生物力學(xué)和組織形態(tài)學(xué)的檢測(cè)。 2.-AAV-LacZ外源病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)移將腺相關(guān)病毒編碼的LacZ-gene(AAV-LacZ)進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)移，檢測(cè)基因治療的可行性。術(shù)后4周，

4、將50μl的無菌培養(yǎng)液(含108IU/ml的AAV-LacZ)注射到每只小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)，共計(jì)5只，對(duì)照組僅注射不含AAV-LacZ的培養(yǎng)液。7天后X-gal染色檢測(cè)AAV-LacZ病毒基因的轉(zhuǎn)移表達(dá)程度 3.Micro CT影像學(xué)檢查術(shù)后均立即進(jìn)行Micro CT掃描，確定鈦釘?shù)奈恢檬欠裾_。每隔4周進(jìn)行一次掃描，記錄鈦釘?shù)奈恢煤陀?jì)算脛骨的骨密度(bone mineral density，BMD)。 4.鈦釘拔拉實(shí)驗(yàn)(Pu

5、ll-out test)離斷膝關(guān)節(jié)，顯露假體鈦釘帽，用定制的鋁桿與鈦釘帽連接，與Instron model8841機(jī)器相連。以2.0 mm/min進(jìn)行牽拉，對(duì)輸出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 5.組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)HE染色觀察鈦釘周圍的新生骨或骨質(zhì)破壞，以及鈦顆粒引起的炎癥反應(yīng)，包括鈦釘周圍的軟組織形成和炎性細(xì)胞浸潤和破骨細(xì)胞的變化；Masson三色染色法檢測(cè)骨膠原的變化；免疫組化染色檢測(cè)致炎細(xì)胞因子IL-1，TNF；CD68檢測(cè)破骨前體細(xì)胞；X

6、-gal染色檢測(cè)外源基因的表達(dá)。 結(jié)論： 1.成功建立了小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)模型Pin-model，模擬了臨床磨損顆粒誘導(dǎo)的松動(dòng)的過程，適合長期實(shí)驗(yàn)研究 2.假體松動(dòng)是一個(gè)慢性連續(xù)性的病理過程，伴隨炎癥細(xì)胞的浸潤，破骨細(xì)胞的活化，導(dǎo)致骨質(zhì)吸收，最終假體松動(dòng) 3.AAV-LacZ病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)移表達(dá)成功，確保了基因治療的可行性 第二部分: AAV-OPG對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)的假體松動(dòng)治療作用的實(shí)驗(yàn)研究前

7、言關(guān)節(jié)假體松動(dòng)是外科關(guān)節(jié)置換的最為常見并發(fā)癥之一。在所有引起關(guān)節(jié)假體松動(dòng)的因素中，尤為重要的因素是磨損顆粒引起的周圍組織反應(yīng)。關(guān)節(jié)翻修手術(shù)經(jīng)常見到UHMWPE等材料的磨損顆粒，組織學(xué)檢查也證實(shí)了這一點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的磨損顆粒，會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬，進(jìn)而激活一系列的炎癥細(xì)胞，釋放炎癥因子和細(xì)胞因子，如IL-1，TNF，IL-6等。這些炎癥因子又會(huì)造成局部組織的炎癥反應(yīng)，激活誘導(dǎo)破骨細(xì)胞至假體-骨界面。影響界面新骨的形成和重塑，導(dǎo)致

8、骨質(zhì)吸收，最終導(dǎo)致無菌性松動(dòng)，手術(shù)失敗。 本實(shí)驗(yàn)擬在已成功建立的Pin-model小鼠模型上，通過體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將腺相關(guān)病毒AAV攜帶的編碼OPG基因(AAV-OPG)轉(zhuǎn)染到術(shù)肢內(nèi)，進(jìn)而檢測(cè)OPG基因治療方案的可行性和有效性。 目的： 1. 在新型Pin-model的基礎(chǔ)上，應(yīng)用AAV-OPG基因治療 2. 檢測(cè)AAV-OPG基因治療的有效性和可行性3. 探討AAV-OPG基因治療作用機(jī)制 方

9、法： 1.小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)動(dòng)物模型的構(gòu)建54只10-12周雌性小鼠分為三組：AAV-OPG，鈦顆粒(Ti particle)和穩(wěn)定(Stable)組。鈦合金釘由Stryker Orthopaedic Inc.制備。鈦粒子Ti-6A1-4V，平均直徑0.53μm，AAV-OPG，由Chapel Hill提供。 2.Micro CT影像學(xué)檢查術(shù)后均立即進(jìn)行Micro CT掃描，確定鈦釘?shù)恼_是否位置。每隔4周掃描一次，記錄鈦

10、釘?shù)奈恢煤陀?jì)算脛骨的BMD。 3.鈦釘Pull-out test離斷膝關(guān)節(jié)，顯露假體鈦釘帽，用定制的鋁桿與鈦釘帽連接，與Instron：model8841機(jī)器相連。以2.0 mm/min進(jìn)行牽拉，對(duì)輸出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 4.組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)HE染色，觀察鈦釘周圍的新生骨或者骨質(zhì)破壞，以及鈦顆粒引起的炎癥反應(yīng)，包括鈦釘周圍的組織形成和細(xì)胞浸潤及，TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞的變化。改良的Masson染色法檢測(cè)骨膠原的變化。免

11、疫組化染色檢測(cè)致炎細(xì)胞因子IL-1，TNF及CD68陽性細(xì)胞的表達(dá)。 5.Real-time PCR檢測(cè)OPG核酸水平變化切取包繞鈦釘?shù)囊欢蚊劰?，研磨提取RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度，轉(zhuǎn)cDNA，進(jìn)行real-time PCR，檢測(cè)OPG核酸變化。 6.酶連免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELASA檢測(cè)OPG蛋白水平變化切取包繞鈦釘?shù)囊欢蚊劰?，研磨離心提取蛋白，分光光度計(jì)檢測(cè)450吸光度值，計(jì)算蛋白濃度，檢