細(xì)胞凋亡模型中HIPPI表達量變化與潛在功能的研究及mtDNA多態(tài)性在PD群體中的調(diào)查.pdf

1、目的：
　　細(xì)胞凋亡(apoptosis)是多細(xì)胞生物應(yīng)對生理及病理性刺激，產(chǎn)生的由基因及其產(chǎn)物調(diào)控的應(yīng)答有序的自主的死亡過程。機體以此消除衰老、損傷與突變的細(xì)胞，維持生理平衡。有關(guān)細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，它與人體眾多生理過程密切相關(guān)，如胚胎發(fā)育、器官的發(fā)育與退化、免疫、造血、細(xì)胞群體穩(wěn)定等，并在獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)、神經(jīng)退行性疾?。ò柶澓Ｄ?、帕金森

2、氏病、舞蹈病）及腫瘤的發(fā)生和治療中起著重要作用。因而，細(xì)胞凋亡的研究日益受到人們的關(guān)注，成為當(dāng)今生物學(xué)的研究熱點之一。細(xì)胞凋亡的主動性和程序性涉及了一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等過程，現(xiàn)已分析鑒定到許多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，如dad-1、ras、myc、p53、bcl-2。近年來，隨著分子生物學(xué)突飛猛進的發(fā)展，關(guān)于細(xì)胞凋亡分子機制的研究有了很大的突破，其中，bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的

3、凋亡調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)系，相互作用，調(diào)控細(xì)胞凋亡。[1]
　　亨廷頓蛋白相互作用蛋白1相互作用因子(HIP-1(Huntingtin-interactingprotein-1)proteininteractor，HIPPI）是細(xì)胞凋亡過程中涉及到的多功能蛋白之一。已有文獻報道，HIPPI在體內(nèi)外與一些蛋白相互作用，使caspase-8活化，進而激活了caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的起始信號，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。[2～5

4、]近期數(shù)據(jù)顯示，在除草劑百草枯(paraquat，PQ)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立起來的帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)研究模型中，發(fā)現(xiàn)了眾多與PD發(fā)病相關(guān)的基因，且這些基因大多與細(xì)胞凋亡有關(guān)，在經(jīng)PQ作用后，半胱天冬酶家族中caspase-3、-6、-7在mRNA水平有所升高，而caspase-1、-5、-9、-10的水平則有所下降[6]。上述表達發(fā)生變化的基因，大多在細(xì)胞凋亡途徑的發(fā)生與發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作

5、用，提示PD的發(fā)病與細(xì)胞凋亡存在著某種程度的相關(guān)性。綜上所述，HIPPI的表達參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，并且可能在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制中扮演著重要角色。
　　除了環(huán)境因素的影響外，遺傳易感性是另一個公認(rèn)的與PD發(fā)生相關(guān)的重要因素。已有文獻指出，線粒體功能異常可能與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，比如PD和阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)[7～9]，且在PD患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了復(fù)合體Ⅰ的損傷[10～13]。在動物模

6、型中，抑制復(fù)合體Ⅰ將導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的選擇性退化，這是PD的一個重要特征[14]。線粒體DNA編碼復(fù)合體Ⅰ的七種蛋白亞單位，線粒體基因組的基因多態(tài)性可能會增加PD的患病風(fēng)險[15]。一些國家在PD患者和對照人群中進行了幾個線粒體單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymotphism，SNP)位點的分型，數(shù)據(jù)顯示，多個線粒體SNP位點可能對PD的發(fā)病有著顯著作用[16～19]。
　　鑒于PD研究模型中發(fā)現(xiàn)了眾

7、多凋亡相關(guān)基因的表達變化，然而HIPPI是否通過細(xì)胞凋亡途徑參與PD的發(fā)病，以及作用機制如何，至今尚無相關(guān)報道;而且，雖然有研究表明HIPPI參與細(xì)胞凋亡等過程，但現(xiàn)階段的研究基本基于HeLa細(xì)胞和Neuro2A細(xì)胞模型[20～23]。本研究采用PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型，輔以氯化鎘(cadmium chloride，CdCl2)誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡模型，研究HIPPI在rnRNA水平及蛋白水平表達量變化及相關(guān)的分子機制

8、，探究HIPPI在細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展過程中所充當(dāng)?shù)慕巧?，進而探究其參與PD發(fā)病的機制。
　　此外，在亞洲人群，尤其是中國人群中，與PD相關(guān)的線粒體多態(tài)性研究匱乏[24]。因此，本課題也運用PCR-RFLP技術(shù)對中國北方322位PD患者和332位健康對照人群進行了5個線粒體SNP位點的分型，比較兩個人群之間的基因頻率和單倍型頻率差異，并在性別分層后進行二者的比較，以探討中國北方人群中這幾個線粒體SNP對PD發(fā)病的影響。這將為PD的預(yù)防

9、和治療提供一定的參考依據(jù)。
　　方法：
　　1、細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒(MTS)檢測HEK293細(xì)胞經(jīng)CdCl2誘導(dǎo)后細(xì)胞的存活率變化，多功能酶標(biāo)儀在490nm波長下讀取吸光度值，并在倒置相差顯微鏡下觀察毒素誘導(dǎo)細(xì)胞后發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變;
　　2、蛋白免疫印跡方法(western blot，WB)檢測CdCl2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞內(nèi)caspase-3前體(pro-Casp-3)及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly A

10、DP-ribose polymerase，PARP）的表達量變化，分析CdCl2可否通過caspase-3依賴的方式誘發(fā)HEK293細(xì)胞凋亡;
　　3、實時熒光定量PCR分析CdCl2誘導(dǎo)前后HEK293細(xì)胞內(nèi)及PQ誘導(dǎo)前后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)HIPPI的mRNA水平表達變化;
　　4、將含HIPPI基因完整編碼區(qū)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中使其過表達;
　　5、WB分析在細(xì)胞中過表達HIPP

11、I后，CdCl2誘導(dǎo)前后HEK293細(xì)胞內(nèi)及PQ誘導(dǎo)前后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)HIPPI蛋白量的變化，以及z-VAD-fmk預(yù)處理對凋亡細(xì)胞中HIPPI蛋白表達變化的影響;
　　6、提取外源性HIPPI蛋白，采用人重組caspase-3、-6、-7分別進行酶切消化，驗證HIPPI蛋白可否被caspase酶切;
　　7、收集中國北方PD患者與健康人群血液樣本，酚-氯仿法提取基因組DNA，采用PCR-RFLP法對5個線粒體SNP位

12、點進行分型，探討其與PD的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、采用30μM CdCl2誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞24h，此時細(xì)胞存活率為50％，基此構(gòu)建細(xì)胞毒性模型;
　　2、CdCl2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞內(nèi)可見pro-Casp-3含量明顯降低，同時部分PARP裂解，泛caspase抑制劑z-VAD-fmk可有效減少CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞內(nèi)pro-Casp-3含量明顯恢復(fù)，說明CdCl2誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞后以cas

13、pase-3依賴的方式導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;
　　3、PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)HIPPI mRNA表達水平增高，CdCl2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞內(nèi)HIPPI mRNA表達水平降低，但二者均無統(tǒng)計學(xué)差異;
　　4、轉(zhuǎn)染HIPPI基因完整編碼區(qū)重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，經(jīng)CdCl2誘導(dǎo)后HIPPI蛋白表達量較對照組明顯下降，而z-VAD-fmk預(yù)處理可有效阻滯這一下降過程;
　　5、在體外研究中，轉(zhuǎn)染HIPPI基因完整編碼

14、區(qū)重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，可檢測到分子量約為55kDa的HIPPI完整蛋白，經(jīng)人重組caspase-3酶切消化后蛋白量顯著降低，而caspase-6、-7酶切后未觀察到明顯蛋白表達量變化;
　　6、中國北方人群中線粒體ND3基因上的A10398G位點與PD相關(guān)，而這一相關(guān)性在女性人群中尤為突出;
　　7、單倍型4336T-5460G-9055G-10398A-13708G的頻率在病例和對照人群之間存在顯著差異，進行性別分

15、層后，單倍型4336T-5460G-9055G-10398G-13708G和4336T-5460G-9055G-10398A-13708G均在女性人群的病例組與對照組之間存在顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1、CdCl2可抑制HEK293細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致HEK293細(xì)胞凋亡;
　　2、伴隨CdCl2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞中過表達的HIPPI蛋白表達水平下降;泛caspase抑制劑可以恢復(fù)CdCl2誘導(dǎo)的HEK