婦科腫瘤組織及血漿中mtDNA突變與細胞凋亡基因表達的研究.pdf

1、目的：旨在研究實體瘤患者原發(fā)性腫瘤及血漿中mtDNA突變和BCL-2、BAX、CASPASE基因的表達，探討mtDNA突變對細胞凋亡的影響及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，并有助于闡明腫瘤發(fā)生的分子機制，尋找新的有價值腫瘤標志物，為腫瘤的臨床診斷、治療以及預(yù)后的判斷提供生物學指標和為抗腫瘤藥物的研究提供新思路。 資料和方法：取32例婦科惡性腫瘤，8例婦科良性腫瘤患者的160份標本，包括腫瘤組織、瘤旁正常組織、外周血單個核細胞(per

2、ipherialbloodmonocytes，PBMC)及血漿標本進行研究，所有手術(shù)切除的標本均根據(jù)WHO標準進行病理學分型、分級及分期。病理類型包括子宮頸癌5例，均為鱗狀上皮癌。子宮內(nèi)膜癌10例(子宮內(nèi)膜樣癌3例，透明細胞癌1例，腺癌6例)。卵巢癌17例(漿液性囊腺癌9例，粘液性囊腺癌4例，混合性囊腺癌3例，透明細胞癌1例)。按FIGO手術(shù)一臨床分期：早期(Ⅰ、Ⅱ期)19例，晚期(Ⅲ、Ⅳ)13例。按WHO組織學分級：Ⅰ～Ⅱ級24例，Ⅲ

3、級8例。8例良性腫瘤中卵巢上皮瘤4例，子宮肌瘤4例。應(yīng)用經(jīng)典的酚、氯仿提取患者血漿、腫瘤組織及正常組織高分子量DNA，采用PCR-SSCP及DNA測序檢測mtDNA突變。提取患者腫瘤組織及正常組織RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測BCL-2、BAX、CASPASE基因的表達。 結(jié)果：1.mtDNA突變率：在32例婦科惡性腫瘤標本中，有22例出現(xiàn)32個基因位點的mtDNA突變，其中18例同時檢測出mtDNA多態(tài)性改變，mtDNA突變率和

4、多態(tài)性頻率分別為68.8％(22/32)和56.3％(18/32)。在8例良性腫瘤標本中，有3例出現(xiàn)4個位點的mtDNA突變，4例出現(xiàn)6個位點的mtDNA多態(tài)性改變，mtDNA突變率和多態(tài)性頻率分別為37.5％(3/8)和50％(4/8)。mtDNA突變率在惡性腫瘤及良性腫瘤組的差異有顯著性(P＜0.05)。在不同種類的婦科惡性腫瘤中，mtDNA突變率和多態(tài)性頻率分別為：宮頸癌80％(4/5)和60％(3/5)，子宮內(nèi)膜癌60％(6/1

5、0)和40％(4/10)，卵巢癌70.6％(12/17)和64.7％(11/17)。 2.mtDNA突變熱點：在發(fā)生于惡性腫瘤的32個突變中，有5個(15.6％)位于ND1基因區(qū)，7個(21.9％)位于ND4基因區(qū)，3個(9.3％)位于ND5基因區(qū)，11個(34.3％)位于CoⅡ基因區(qū)，16個(50％)位于cytb基因區(qū)。在發(fā)生于良性腫瘤的4個突變中，1個(25％)位于ND4基因區(qū)，3個(75％)位于cytb基因區(qū)。結(jié)果表明，m

6、tDNA的突變熱點位于cytb基因區(qū)，該基因突變頻率最高，其次屬CoⅡ基因。 3.mtDNA多位點突變：在mtDNA突變的22例中，僅有一個基因突變者8例，包括ND1基因突變1例，cytb基因突變3例，CoⅡ基因突變4例；大部分63.6％(14/22)涉及到2個基因以上的突變。其中同時涉及2個基因突變者9例，包括ND5+cytb基因突變和ND1+cytb基因突變各1例，ND4+cytb基因突變2例，CoⅡ+cytb基因突變5例；

7、同時涉及ND4+ND5+cytb三個基因突變者1例；同時涉及4個基因突變者3例，包括ND1+ND4+ND5+cytb基因突變1例，ND1+ND4+CoⅡ+cytb基因突變2例。 4.血漿標本中mtDNA突變：為了進一步了解血漿中mtDNA突變的情況，對腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變的患者，又進行了相應(yīng)的血漿標本的PCR-SSCP分析，以PBMC作為自身對照。22例中有20例(90％)擴增到PCR產(chǎn)物，其中9例(45％)發(fā)現(xiàn)了與腫瘤

8、組織中一致的陽性結(jié)果。 5.mtDNA突變與細胞凋亡基因表達的相關(guān)性：在mtDNA突變的22例中，20例(90.9％)同時檢測到bcl-2的表達，而非突變組的10例中，bcl-2的表達率僅為50％。其差異有顯著性意義(P＜0.05)。Bax及caspase基因在mtDNA突變組的表達率分別為27.3％和13.6％，明顯低于非突變組的80％，差異均有非常顯著性意義(均P＜0.01)。表明mtDNA突變與bcl-2表達呈正相關(guān)，而與

9、Bax及caspase基因表達呈負相關(guān)。 結(jié)論：在婦科惡性腫瘤中存在mtDNA編碼區(qū)的高頻率變異，mtDNA總突變率為68.8％。在不同種類的婦科惡性腫瘤中，mtDNA突變率分別為：宮頸癌80％，子宮內(nèi)膜癌60％，卵巢癌70.6％，提示mtDNA編碼區(qū)變異與婦科惡性腫瘤的形成有密切關(guān)系，可能是婦科惡性腫瘤發(fā)生機制中的一個重要的核外分子遺傳學改變。mtDNA的突變熱點位于cytb基因區(qū)，cytb基因的突變可能會對線粒體的氧化過程產(chǎn)

10、生顯著的影響。mtDNA突變?yōu)槎嗷?、多位點的突變，大部分(63.6％)涉及到2個基因以上的突變。良性腫瘤mtDNA突變率(37.5％)顯著低于惡性腫瘤組，差異有顯著性。表明良性腫瘤與惡性腫瘤的發(fā)生有著不同的分子學基礎(chǔ)。mtDNA突變在腫瘤的病理類型、臨床期別及組織學分級之間的差異無顯著性，提示mtDNA變異可能是婦科惡性腫瘤形成中的一個早期現(xiàn)象，并持續(xù)存在于癌癥演變的全過程。mtDNA突變與細胞凋亡基因表達亦具有一定的相關(guān)性，其與bc