營養(yǎng)性肥胖合并脂代謝異常對雄性大鼠生殖功能的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景:
　　眾所周知，營養(yǎng)性肥胖和高脂血癥作為代謝綜合征的重要表現(xiàn)，嚴(yán)重影響著人健康，已成為全世界公共健康關(guān)注的焦點(diǎn)。營養(yǎng)性肥胖容易發(fā)生內(nèi)臟性肥胖，導(dǎo)致脂代謝紊亂，而高脂血癥也通常同時伴有肥胖的發(fā)生，二者往往相互伴隨，密不可分。脂代謝紊亂和肥胖都與不健康的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，進(jìn)食過高熱量容易發(fā)生代謝紊亂，均能夠引起復(fù)雜的新陳代謝、分泌和血液動力學(xué)變化，是發(fā)生動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素，導(dǎo)致多種

2、不良后果發(fā)生。而且近年來二者對于生殖系統(tǒng)的影響備受關(guān)注。生殖異常是肥胖和脂代謝紊亂個體中常見的現(xiàn)象。既往研究過多著重于肥胖和高脂血癥對于女性生殖系統(tǒng)的影響，如導(dǎo)致月經(jīng)不規(guī)律、不孕不育、與胰島素抵抗相伴隨的多囊卵巢綜合征等，近來對于男性生殖系統(tǒng)的影響研究逐漸成為熱點(diǎn)，越來越受到醫(yī)學(xué)界和社會的重視。事實上，一直的觀點(diǎn)認(rèn)為肥胖男性患者的睪酮濃度降低，而當(dāng)體重減輕時則睪酮濃度升高。同樣地，與非肥胖個體相比，促黃體激素(LH)釋放在肥胖病人中顯著

3、降低。
　　正常細(xì)胞的凋亡是機(jī)體組織清除損壞或者衰老等類型細(xì)胞的方式。從胚胎發(fā)生開始，到接下來的機(jī)體生長發(fā)育過程，細(xì)胞凋亡都發(fā)揮著不可替代的功能。遺傳信息的正確傳遞依賴于睪丸生殖細(xì)胞的正常凋亡，凋亡有利于及時清除畸形的或者結(jié)構(gòu)不完整的有缺陷的細(xì)胞，并且支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)是生精細(xì)胞得到營養(yǎng)的主要來源，如果沒有凋亡，支持細(xì)胞數(shù)量有限，無法給予生精細(xì)胞提供充足的支持和營養(yǎng)，使得生精細(xì)胞數(shù)量雖多，但質(zhì)量下降，導(dǎo)致生殖功能紊亂。相反地，過多凋亡

4、也會因為生精細(xì)胞數(shù)量減少從而導(dǎo)致生殖功能障礙。而在細(xì)胞凋亡機(jī)制中，線粒體凋亡的因素尤其重要。凋亡發(fā)生時，線粒體發(fā)揮重要的作用，線粒體膜通透性增加，細(xì)胞一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)生成增多，NOS是催化成為NO的重要酶，可以以多種形式在睪丸組織中表達(dá)，如神經(jīng)型、內(nèi)皮型等，許多重金屬、非電離輻射等理化因素可通過對NOS活性的影響從而引起NO的變化，而NO在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。線粒體凋亡中就會

5、因NOS的變化從而使得三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate， ATP)酶活性顯著降低，從而胞漿中膜間蛋白細(xì)胞色素C(Cyt c)含量增加，進(jìn)一步激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等凋亡相關(guān)因子，引起凋亡的發(fā)生。肥胖及脂代謝異常所導(dǎo)致的生殖功能低下與諸多因素相關(guān)，細(xì)胞凋亡便是其中之一。
　　男性生殖功能障礙還通常由于雄激素減少所引起。睪酮和雙氫睪酮均是體內(nèi)重要的雄激素，雙氫睪酮生物活性更大，睪酮

6、在富含5-α還原酶的性腺器官，如前列腺、附睪等可還原為有著更強(qiáng)雄激素作用的雙氫睪酮。睪酮有著生殖生理功能和非生殖生理功能兩方面重要作用。生殖生理功能方面，睪酮有維持男子性功能和副性特征、維持雄性攻擊意識的作用。非生殖生理功能方面，睪酮有促進(jìn)三大物質(zhì)如糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝及核酸合成的作用，還有著影響肝臟諸多血漿蛋白質(zhì)的合成、分泌，刺激腎臟組織促紅細(xì)胞生成素分泌、觸發(fā)造血干細(xì)胞分化為原紅細(xì)胞的作用，另外還能刺激組織攝取氨基酸，還是很強(qiáng)的生長

7、刺激激素，能通過刺激骨細(xì)胞增殖，加速血管及周圍間質(zhì)細(xì)胞增生及鈣鹽沉積，從而促進(jìn)骨骼和肌纖維生長，而且對于心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的分化都有著顯著作用。對于男性生育能力的評價除了配偶妊娠外還包括對于睪酮、黃體生成素等激素水平的檢測。常見的生殖功能障礙的表現(xiàn)多為性欲減退，勃起障礙，從而導(dǎo)致生殖能力下降。既往研究表明肥胖和脂質(zhì)代謝紊亂均可導(dǎo)致男性減少睪酮的合成和增殖。
　　睪酮的合成和增殖也受諸多因素的影響。StAR、P450sc

8、c是睪酮生成過程中重要的兩個限速酶，在睪酮合成過程中發(fā)揮著重要的作用。另外促黃體生成素(LH)可直接作用于間質(zhì)細(xì)胞膜上的促黃體生成素受體(LHR)，啟動并調(diào)節(jié)睪酮的合成。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑——AC-cAMP-PKA途徑在其中發(fā)揮了重要的作用。當(dāng)促性腺激素與細(xì)胞膜上相關(guān)受體結(jié)合后能通過激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，從而將細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上調(diào)，將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)信號。而cAMP作為第二信使，催化并激活蛋白激酶A(protein

9、kinase A，PKA)，從而調(diào)節(jié)睪酮合成相關(guān)基因的表達(dá)。這其中任何一個環(huán)節(jié)受損都會影響到睪酮的合成，從而影響生殖功能。
　　綜上，正常生殖功能的維持需要激素的分泌、生精細(xì)胞的質(zhì)量、數(shù)量得以保證發(fā)揮正常功能以及下丘腦垂體性腺軸的綜合調(diào)控等多方面的作用，而且這些因素相互影響，共同作用，有的存在正負(fù)反饋效應(yīng)，起著協(xié)調(diào)功能，每個因素缺一不可。隨著近年來對于脂代謝紊亂和肥胖對于生殖功能的影響研究增多及精準(zhǔn)醫(yī)療概念的推廣，對于疾病發(fā)病機(jī)制

10、的研究更為深入。而導(dǎo)致雄性生殖功能低下及不育也有內(nèi)分泌、遺傳及性交功能異常等多方面的病因，本文擬從生精細(xì)胞凋亡及內(nèi)分泌相關(guān)激素角度，依靠分子生物學(xué)、生物化學(xué)等方法，通過建立高熱量誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖脂代謝異常雄性大鼠模型，檢測血脂相關(guān)生化指標(biāo)的變化，并檢測與細(xì)胞凋亡有關(guān)的Cyt c、caspase-3基因mRNA和蛋白表達(dá)，以及檢測血清和睪丸中睪酮含量，觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)改變，選取睪酮合成關(guān)鍵酶基因信號通路為研究靶點(diǎn)，檢測StAR、P450

11、scc及AC-cAMP-PKA通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)差異。通過分析在大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中對于睪酮的合成和增殖起關(guān)鍵作用的上述不同蛋白質(zhì)的表達(dá)，初步探討肥胖合并高脂影響生殖功能的可能機(jī)制，以研究其對于雄性生殖系統(tǒng)的危害。本文研究著重從發(fā)病機(jī)制和病因探究肥胖合并脂代謝異常導(dǎo)致的生殖功能減弱，可為臨床工作提供理論鋪墊，為后期治療脂代謝紊亂導(dǎo)致的男性生殖功能低下相關(guān)疾病提供了指導(dǎo)方向。
　　研究方法:
　　7周齡健康雄性SD大鼠共3

12、0只，每組15只隨機(jī)分配，分別為高熱量高脂飲食組和正常飲食對照組。高脂組給予特別配制的高脂、高熱量飼料喂養(yǎng)，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。兩組大鼠于實驗開始第0天和16周后，分別測量體長(cm)，計算Lee's指數(shù)[Lee's指數(shù)=體重(g)1/3×103/體長(cm)]，期間每周稱量大鼠體重一次并記錄;外周血中的膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)采用全自動生化分析儀(ACA)進(jìn)行檢測;第16周末處死大鼠取睪

13、丸并稱取附睪周圍脂肪塊重量，并立即取睪丸并保存標(biāo)本。RT-PCR主要用來驗證兩組大鼠睪丸組織中Cyt c、caspase-3基因mRNA的不同，免疫組織化學(xué)方法用來檢測Cyt c、caspase-3蛋白的表達(dá);對于睪丸組織形態(tài)的微觀變化采用HE染色法觀察，使用TUNEL方法主要比較兩組大鼠細(xì)胞凋亡的差異。同時檢測大鼠血清性激素，并觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)，分別提取大鼠睪丸組織中的RNA和總蛋白，運(yùn)用半定量RT-PCR法和Western

14、blot法檢測睪酮合成中StAR、P450scc等基因和蛋白的表達(dá)差異，并采用ELISA方法檢測腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠體重、體長、Lee's Index、附睪周圍脂肪重量(EAM)及脂代謝相關(guān)指標(biāo)的觀察高脂飼養(yǎng)組和對照組大鼠體重、體長及Lee's指數(shù)在喂養(yǎng)第0周無顯著性差異。喂養(yǎng)第16周末，高脂飼養(yǎng)組相比對照組鼠體重增長較快，Lee's指數(shù)及附睪周圍脂肪塊重量明顯高于

15、16周末對照組。與對照組相比，高脂飼料喂養(yǎng)組SD大鼠外周血TC、TG水平明顯升高，HDL-C水平明顯下降(p＜0.05)。
　　2.大鼠睪丸組織病理觀察
　　HE染色發(fā)現(xiàn):正常對照組大鼠的精原、精母及精子細(xì)胞均外形完整，無明顯破壞，三種生精細(xì)胞的染色質(zhì)形狀分別為圓粒狀、團(tuán)塊狀及致密均勻狀。而肥胖高脂組則發(fā)現(xiàn)生精上皮殘缺不完整，結(jié)構(gòu)疏松、間隙增大，原有的正常連接缺如，可見精母細(xì)胞脫落壞死，而且大鼠睪丸生精小管出現(xiàn)萎縮，間質(zhì)增加

16、，小管內(nèi)精子發(fā)生阻滯。
　　以上結(jié)果表明肥胖合并高脂可導(dǎo)致生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生變化。
　　3.大鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞的觀察
　　在16周末，對照組大鼠睪丸組織中細(xì)胞凋亡數(shù)目較少，尤其是精子及精子細(xì)胞極少見，僅出現(xiàn)分散的以精母和精原細(xì)胞的凋亡。而肥胖高脂組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組顯著升高(P＜0.05)。
　　以上結(jié)果表明肥胖合并高脂狀態(tài)可顯著增加生精細(xì)胞的凋亡。
　　4.大鼠睪丸組織中Cyt c和Casp

17、ase-3 mRNA和蛋白表達(dá)情況
　　RT-PCR以及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)在肥胖高脂組中可見明顯增加，同樣肥胖合并高脂組大鼠睪丸中Cyt c mRNA、蛋白表達(dá)也較正常對照組明顯增加。
　　以上結(jié)果表明在肥胖高脂狀態(tài)下Cyt c和Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，而二者為線粒體凋亡過程中重要因子，故而推論肥胖合并高脂可能通過線粒體途徑導(dǎo)致生精細(xì)胞的凋亡。
　　5.

18、大鼠性激素水平和睪丸形態(tài)學(xué)
　　肥胖高脂組與對照組相比，血清睪酮、SHBG、LH和IGF-1水平顯著降低，且睪丸中合成睪酮也明顯減少。睪丸組織中曲細(xì)精管細(xì)胞層數(shù)較對照組減少，生精細(xì)胞中有諸多脂滴堆積，細(xì)胞與細(xì)胞之間空隙增大變寬，還可見無功能的空泡樣改變。
　　以上結(jié)果表明高脂可通過影響與睪酮合成相關(guān)激素以及性腺器官的微觀結(jié)構(gòu)從而影響雄性生殖系統(tǒng)。
　　6.肥胖合并脂代謝異常導(dǎo)致雄性生殖損傷的機(jī)制探討
　　肥胖合并

19、脂代謝紊亂可導(dǎo)致StAR、P450scc蛋白表達(dá)水平下降，可顯著降低AC活性和cAMP含量，而對LHR mRNA和蛋白的表達(dá)水平無明顯影響，提示肥胖合并脂代謝紊亂是通過降低血清中LH的水平，減少LH與LHR的結(jié)合，進(jìn)而影響AC-cAMP-PKA途徑，最終導(dǎo)致睪酮合成酶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平降低。
　　結(jié)論:
　　1.營養(yǎng)性肥胖合并脂代謝異常導(dǎo)致了生精細(xì)胞凋亡的明顯增多并可以引起生殖細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化。
　　2.肥胖合并脂代