miR-183介導EMT在肺腺癌細胞放射抗拒中的作用探討.pdf

1、目的：
　　放療是非小細胞肺癌治療的主要手段之一，放射抵抗是影響NSCLC放療療效的重要原因，EMT是放射抵抗產生的主要原因。研究表明肺腺癌放射抗拒細胞發(fā)生了EMT表型的改變，且miR-183在肺腺癌放射抗拒細胞株中表達增高，提示miR-183可能介導EMT并在肺腺癌細胞放射抗拒中發(fā)揮作用。因此對miR-183調控機制的深入探討，將有望闡明其與EMT的關系及二者在肺腺癌細胞放射抵抗中的作用，為臨床上尋找提高NSCLC放射治療療效的

2、靶點提供新的思路。
　　方法：
　　倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學的改變；CCK-8細胞增殖實驗比較不同細胞接受相同劑量照射后細胞生存率的差異；克隆形成實驗比較細胞放射抗拒性能之間的差異；劃痕愈合實驗比較細胞遷移能力的改變；qPCR法檢測細胞中miR-183的表達，qPCR及Western Blot分別檢測ZEB1及EMT相關分子標志物mRNA及蛋白表達水平的改變；慢病毒轉染實驗實現對H1299及H1299R細胞中miR-183基

3、因的上/下調。
　　結果：
　　1.X射線持續(xù)照射后，肺腺癌細胞的形態(tài)發(fā)生了變化，由原本緊密連接的上皮細胞形態(tài)變成連接疏松、形態(tài)狹長并伸出偽足的類似成纖維細胞形態(tài)；在課題組前期的研究中：克隆形成實驗表明，相比于H1299細胞，H1299R細胞的存活肩區(qū)更寬，放射抗拒性更強（P<0.05）；CCK-8細胞增殖實驗表明，相比于H1299細胞，H1299R細胞在接受亞致死劑量（6Gy）X射線照射后，表現出更高的生存率（P<0.05

4、）；qPCR檢測發(fā)現，miR-183、ZEB1、Vimentin在H1299R細胞中高表達（P<0.05），E-cadherin表達變化無差異（P>0.05）；Western Blot檢測發(fā)現，ZEB1、Vimentin在H1299R細胞中高表達，E-cadherin表達降低（P<0.05）。
　　2.成功構建干擾miR-183表達的慢病毒載體，qPCR驗證miR-183在H1299R-shRNA-miR183細胞中表達降低（P<

5、0.05）。進一步克隆形成實驗表明，相比于陰性對照H1299R-shRNA-NC細胞，干擾miR-183表達后的H1299R-shRNA-miR183細胞的存活肩區(qū)變窄，放射抗拒性減弱（P<0.05）；CCK-8細胞增殖實驗表明，相比于H1299R-shRNA-NC細胞，H1299R-shRNA-miR183細胞在接受4Gy X射線照射后，生存率降低（P<0.05）；劃痕愈合實驗發(fā)現，H1299R-shRNA-miR183細胞的劃痕愈合

6、時間相對延長，細胞遷移能力減弱（P<0.05）；qPCR及Western Blot檢測發(fā)現在基因及蛋白水平ZEB1、Vimentin在 H1299R-shRNA-miR183細胞中表達均降低，E-cadherin表達均相對增高（P<0.05）。
　　3.成功構建miR-183上調表達的慢病毒載體，qPCR驗證miR-183在H1299-EGFP-miR183細胞中表達增高（P<0.05）。進一步克隆形成實驗表明，相比于陰性對照H1

7、299-EGFP-NC細胞，miR-183上調表達后的H1299-EGFP-miR183細胞的存活肩區(qū)變寬，放射抗拒性增強（P<0.05）；CCK-8細胞增殖實驗表明，相比H1299-EGFP-NC細胞，H1299-EGFP-miR183細胞在接受4Gy X射線照射后，生存率增高（P<0.05）；劃痕愈合實驗發(fā)現，H1299-EGFP-miR183細胞的劃痕愈合時間相對縮短，細胞遷移能力增強（P<0.05）；qPCR及Western B

8、lot檢測發(fā)現在基因及蛋白水平ZEB1、Vimentin在H1299-EGFP-miR183細胞中表達均增高，而E-cadherin表達均相對降低（P<0.05）。
　　結論：
　　1.持續(xù)X射線照射過程中，H1299細胞發(fā)生了EMT，其增殖活性增強，放射抗拒能力增加；
　　2.miR-183在H1299細胞發(fā)生放射抗拒的過程中表達增高，并在其中發(fā)揮重要作用：過表達miR-183的表達，可能會促進H1299細胞發(fā)生EM