大鱗副泥鰍尾鰭再生相關基因PdGig2和PdFrr2的克隆及表達分析.pdf

1、發(fā)育成熟的個體在受損后可以在原有組織基礎上重建已丟失的組織，這種現(xiàn)象稱為再生。所有生物體對組織損傷會做出相應的生理反應，同時與疾病的發(fā)生又密切相關，因此研究再生的過程和機制具有重要的意義。哺乳類動物再生能力非常有限，而以蠑螈為代表的有尾兩棲類和以斑馬魚為代表的硬骨魚能夠在附肢及魚鰭截斷后通過割處再生完成結構和功能的重建。但兩棲類繁殖速度慢，實驗室不易飼養(yǎng)，且缺乏相應的遺傳操作技術，不能成為理想的研究動物。魚鰭在切斷后卻能夠完整的恢復原有

2、結構，并且相對簡單，易獲得，損傷后不危害機體生命，更具意義的是硬骨魚魚鰭與人類在內(nèi)的四足動物肢體早期發(fā)育極其相似，但二者再生能力卻大不相同，因此魚鰭可以作為解析分子再生機制的良好體系。
　　本研究先是從已經(jīng)建立的抑制性消減雜交文庫中篩選得到兩個魚鰭再生差異表達明顯很大的ESTs，在這兩個ESTs的基礎上，采用RACE的方法進行擴增，得到兩個cDNA全長序列。通過Blast比對后，其中一個基因認為是Gig2基因，另一個Blast結果

3、并未發(fā)現(xiàn)有與高度同源的，認為是一個新基因，將其命名為Frr2基因。隨后利用DNAMAN，MEGA6.0，sigmaplot等軟件對這兩個基因進行生物學分析，還測定了這兩個基因在不同組織中的表達。
　　Gig2基因是草魚出血性病毒誘導的基因2，它首先是從紫外失活的GCHV處理的鯽魚囊胚細胞中鑒定獲得的一個新基因。它在魚類干擾素抗病毒反應中起著重要作用，而在再生中能夠調(diào)節(jié)再生則可能是一個新發(fā)現(xiàn)。它cDNA全長是712bp，共編碼156

4、個氨基酸，相對分子質(zhì)量為17.324KDa，等電點(pI)8.69。46個極性氨基酸，71個非極性疏水氨基酸，18個酸性氨基酸，21個堿性氨基酸。蛋白質(zhì)二級結構發(fā)現(xiàn)α-螺旋占23.72％，延伸鏈占27.56％，β-轉(zhuǎn)角占16.03％，無規(guī)卷曲占32.69％。通過半定量以及熒光定量檢測發(fā)現(xiàn):在再生后4d表達達到最高水平，在胚胎發(fā)育時期的出膜期表達量最高，還發(fā)現(xiàn)在精巢組織表達也是最大的。根據(jù)Gig2的表達模式我們首次發(fā)現(xiàn)了該基因參與到了魚鰭

5、再生的過程，它可能在魚鰭結構形成過程中起著調(diào)控作用。同源度結果分析發(fā)現(xiàn)Gig2基因與其他物種的同源度相對并不是很大，這也使得研究其進化關系引起很大興趣。
　　Frr2(fin regeneration related gene2)基因是一個未知基因，它是一個與魚鰭再生相關的一個基因。cDNA全長為1036bp，編碼了有88個氨基酸，二級結構發(fā)現(xiàn)其中α螺旋占46.59％，β-轉(zhuǎn)角占9.09％，無規(guī)卷曲占32.95％，延伸鏈占11.3

6、6％。半定量以及熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)在再生不同時期(0dpa，2dpa，3dpa，4dpa，5dpa，6dpa)的第四天表達最高，在不同組織(肝、心、腦、精巢、腎、卵巢)中心臟表達水平較高，胚胎不同發(fā)育時期(囊胚期，原腸胚，神經(jīng)胚，尾芽期，出膜期)原腸胚期的基因表達水平最高。冰凍切片把處于再生不同時期的尾鰭進行原位雜交。原位雜交結果顯示:發(fā)現(xiàn)在魚鰭內(nèi)部成骨細胞中有表達，在4dpa表達信號最強。我們推測Frr2基因可能參與到了成骨細胞的增殖和