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文檔簡介
1、1型糖尿病(Type1 diabetes mellitus,T1DM)又稱胰島素依賴型糖尿病,是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的,以胰島β細(xì)胞損傷為主要特征的器官特異性自身免疫病。CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)在T1DM病程中有著重要作用,是胰島β細(xì)胞的直接破壞者,對T1DM的發(fā)生和發(fā)展不可或缺。
與其他自身免疫病一樣,T1DM病程中存在表位擴(kuò)展的現(xiàn)象,胰島素(insulin,Ins)作為目
2、前公認(rèn)的啟動抗原,對于其他自身抗原的暴露及相應(yīng)CTLs的誘導(dǎo)有著關(guān)鍵作用。在常用的T1DM動物模型——非肥胖型糖尿病(nonobese diabetic,NOD)小鼠中,胰島素抗原中主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ限制性的優(yōu)勢表位是insulin B15-23(LYLVCGERG,簡寫為InsB15-23),由MHCⅠ類分子H-2Kd遞呈。本文旨在制備檢測InsB15-2
3、3特異性CTLs的工具并探究InsB15-23特異性CTLs在T1DM病程中的作用。
目前CTLs直接檢測常用以四聚體(tetramer)技術(shù)為代表的MHCⅠ多聚體(multimer)技術(shù),但需要先將原核表達(dá)的MHCⅠ類分子、β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)與抗原肽體外稀釋復(fù)性成MHCⅠ∶肽(pMHCⅠ)復(fù)合物,再將數(shù)個pMHCⅠ單體多聚化,所以對抗原肽與MHCⅠ類分子的親和力要求較高,低親和力抗原肽難
4、以制備出穩(wěn)定的pMHCⅠ單體,多聚體就更無從談起。天然InsB15-23肽第九位甘氨酸殘基側(cè)鏈過小,導(dǎo)致其與H-2Kd的親和力很弱,使我們在研究工具上遇到了障礙。目前常用的解決辦法是將InsB15-23肽第九位的甘氨酸突變?yōu)閭?cè)鏈更大的纈氨酸(G9V突變),以增強(qiáng)抗原肽與H-2Kd抗原結(jié)合槽的錨定能力。但有報(bào)道表明改造肽制備的多聚體的識別譜可能與天然肽有差異。為了尋求在不影響特異性的前提下提高天然InsB15-23肽與H-2Kd的親和力的
5、方法,本研究采用了二硫鍵捕獲型單鏈三聚體(disulfide-trap single-chain trimer,dtSCT)技術(shù)。
dtSCT技術(shù)是將抗原肽、β2m和MHCⅠ類分子以柔性接頭(linker,L)依次連接,并在抗原肽的C末端與MHCⅠ類分子間引入了二硫鍵,將抗原肽“卡”在抗原結(jié)合槽中。這樣整個融合分子的穩(wěn)定性大大提高,并能獲得類似天然pMHCⅠ復(fù)合物的構(gòu)象和生物學(xué)功能。但是dtSCT分子中抗原肽C端共價結(jié)合的li
6、nkerl的存在會迫使抗原肽最后一位氨基酸殘基旋轉(zhuǎn)90度,從而降低抗原肽與MHCⅠ類分子的親和力,這稱為“C端凸出”。dtSCT分子的穩(wěn)定性受抗原肽共價結(jié)合和“C端凸出”兩方面影響,最終的凈效應(yīng)仍然與抗原肽與MHCⅠ類分子的親和力相關(guān)。
目前已有多篇報(bào)道說明dtSCT技術(shù)對于病毒或細(xì)菌來源的親和力較高的抗原肽效果很好,能夠使dtSCT分子中的抗原肽對外源性肽競爭性取代的抵抗力比傳統(tǒng)四聚體分子強(qiáng)1000倍。為了系統(tǒng)地檢驗(yàn)dtSC
7、T技術(shù)對InsB15-23肽這樣的低親和力肽是否適用,本研究構(gòu)建了四種可溶性dtSCT(soluble dtSCT,簡寫為sdtSCT)單體分子用于四聚體制備,分別是InsB15-23 sdtSCT、InsBG9V sdtSCT、InsBQ115E sdtSCT以及InsBG9V/Q115E sdtSCT,其中Q115E突變的引入是為了增強(qiáng)MHCⅠ類分子與CD8分子的親和力。研究證實(shí),四種sdtSCT單體很穩(wěn)定,并且制成的四聚體的非特異
8、性標(biāo)記水平都很低,對陰性對照小鼠BALB/c小鼠的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的非特異性標(biāo)記水平分別為0%、0.06%、0.02%和0.07%,脾臟淋巴細(xì)胞非特異性標(biāo)記水平分別為0.01%、0.03%、0.04%和0.05%;而商品化G9V傳統(tǒng)五聚體對BALB/c小鼠的PBMC和脾臟淋巴細(xì)胞的非特異性標(biāo)記水平分別為0.07%和0.04%。可見自制的四種四聚體與商品化傳統(tǒng)
9、五聚體的非特異性標(biāo)記水平基本相當(dāng)。另一方面,自制的四種四聚體都能檢測出4周齡NOD雌鼠PBMC中低水平的InsB15-23特異性CTLs,分別為0.29%、0.69%、0.89%和1.03%,對脾臟淋巴細(xì)胞的檢測結(jié)果分別是0.03%、0.03%、0.15%和0.20%;商品化G9V傳統(tǒng)五聚體對4周齡NOD雌鼠PBMC和脾臟淋巴細(xì)胞中InsB15-23特異性CTLs的檢出率分別為0.46%和0.09%。四種自制四聚體中,至少InsBQ11
10、5E sdtSCT和InsBG9V/Q115E sdtSCT四聚體對4周齡NOD雌鼠體內(nèi)低水平InsB15-23特異性CTLs的檢出率高于商品化傳統(tǒng)五聚體。這樣就從原核表達(dá)水平證明了即使是親和力這么弱的InsB15-23肽,dtSCT分子中肽共價結(jié)合的優(yōu)勢足以彌補(bǔ)“C端凸出”的影響,使sdtSCT型四聚體具有比商品化G9V傳統(tǒng)五聚體更好的表現(xiàn),說明dtSCT技術(shù)很可能是解決低親和力抗原肽多聚體制備難題的一個好方法。
由于Q11
11、5E突變不會引起四聚體識別譜的改變,且InsBQ115E sdtSCT四聚體的檢出率又僅次于InsBG9V/Q115E sdtSCT,高于商品化G9V傳統(tǒng)五聚體,所以本研究又構(gòu)建了InsBQ115E的膜表達(dá)型dtSCT分子(membrane-expressed dtSCT,簡寫為mdtSCT)。將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-),皮下免疫NOD小鼠,觀察其體內(nèi)誘生InsB15-23特異性CTLs的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),InsBQ11
12、5E mdtSCT真核表達(dá)載體確實(shí)能在NOD小鼠的外周血和脾臟中誘生出更多InsB15-23特異性CTLs。三次免疫后,mdtSCT免疫組NOD小鼠的外周血中InsB15-23特異性CD8+T細(xì)胞頻率為1.93±0.55%,與空質(zhì)粒對照(0.22±0.11%)有極顯著差異(p<0.01);脾臟中InsB15-23特異性CD8+T細(xì)胞頻率為0.83±0.31%,與空質(zhì)粒對照(0.37±0.20%)亦有極顯著差異(p<0.01)。這樣我們又
13、從真核表達(dá)水平對dtSCT分子的生物學(xué)功能進(jìn)行了驗(yàn)證。
最后,本研究還用InsBQ115E mdtSCT對3周齡NOD雌鼠進(jìn)行了免疫干預(yù),發(fā)現(xiàn)InsBQ115EmdtSCT分子能減輕NOD小鼠胰島單個核細(xì)胞的浸潤程度,并對NOD小鼠T1DM具有免疫保護(hù)作用,30周齡時NOD小鼠的發(fā)病率僅為9%,而空質(zhì)粒對照組的發(fā)病率為60%。并且還發(fā)現(xiàn)這種免疫保護(hù)作用是IGRP非依賴性的。
綜上所述,本研究通過引入MHCⅠ類分子的d
14、tSCT技術(shù),成功制備出傳統(tǒng)多聚體技術(shù)無法制備的低親和力表位肽InsB15-23的四聚體,并經(jīng)過了功能驗(yàn)證,證明了dtSCT技術(shù)在低親和力表位肽的MHCⅠ多聚體制備方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。本研究成功利用InsBQ115EmdtSCT對低周齡NOD小鼠進(jìn)行免疫干預(yù),顯著降低了NOD小鼠T1DM的發(fā)病率,為T1DM的治療提供了一種有希望的、安全型更好的特異性免疫新療法。但I(xiàn)nsBQ115E mdtSCT對NOD小鼠T1DM免疫保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制還
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